骨肉瘤細(xì)胞MG63中內(nèi)源性microRNA-27a對骨肉瘤惡性行為的影響及其調(diào)控靶基因的研究.pdf

1、背景：
　　骨肉瘤是高度惡性骨腫瘤，多見于兒童和青少年，臨床治療非常困難。盡管新輔助化療明顯提高了生存率，但近30年骨肉瘤的生存率沒有得到進(jìn)一步的提高，5年生存率和總的生存率一直徘徊在50-60％，單純截肢患者常于一年內(nèi)死于肺轉(zhuǎn)移。已經(jīng)有大量的學(xué)者對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，這有助于更早、更準(zhǔn)確的診斷，以及開發(fā)新的治療方案。盡管對骨肉瘤的分子機(jī)制的理解正在逐漸加深，但其復(fù)雜的分子機(jī)制仍然沒有得到很好的了解。

2、　　microRNA（miRNA，小RNA）是內(nèi)源性，非編碼，單鏈RNA，長度為19-25個(gè)核苷酸，通過促進(jìn)靶mRNA降解或抑制靶mRNA水平的蛋白質(zhì)翻譯而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。越來越多的資料顯示miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)譜可用于腫瘤的早期診斷，腫瘤分型并可判斷腫瘤的預(yù)后以及對特定治療方案的敏感性，甚至可以作為有效的治療靶點(diǎn)。而且已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中miRNA表達(dá)譜的改變。但這些改變的miRNA

3、表達(dá)譜對骨肉瘤的影響和意義及其內(nèi)在的調(diào)控靶基因尚未進(jìn)行深入的研究。因此很有必要對骨肉瘤細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
　　已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中miR-27a表達(dá)升高，具有促進(jìn)腫瘤的作用，而且骨肉瘤中miR-27a的表達(dá)也是升高的，但其作用機(jī)制仍不明確，本研究擬通過體外試驗(yàn)來明確miR-27a在骨肉瘤細(xì)胞中的作用并探討其作用機(jī)制。
　　目的：
　　1.探討MAP2K4與miR-27a之間的靶向關(guān)系。
　　2.

4、構(gòu)建miR-27a特異性抑制劑轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞，明確miR-27a對骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。
　　3.通過Western blotting檢測JNK/p38信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平的改變，探討miR-27a在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展上的分子機(jī)制。
　　方法：
　　通過生物軟件預(yù)測miR-27a的靶基因，構(gòu)建靶基因報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞后進(jìn)一步驗(yàn)證miR-27a對靶基因MAP2K4的調(diào)節(jié)作用。
　　

5、體外培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞株MG63，處理組和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染miR-27a特異性抑制劑及陰性對照抑制劑，通過MTT法、集落形成試驗(yàn)、小室遷移試驗(yàn)等檢測其對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞行為的影響來明確miR-27a在骨肉瘤細(xì)胞中的作用。并通過Western blotting檢測JNK/p38信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果：
　　1.MAP2K4是miR-27a的一個(gè)靶基因用三大常用的miRNA數(shù)據(jù)庫Target

6、Scan、miRBase和Pictar來預(yù)測miR-27a的目標(biāo)基因。結(jié)果檢測到MAP2K4 mRNA的3'UTR有兩個(gè)可能的結(jié)合部位。將MAP2K4的3'UTR序列克隆到pGL3載體，位于螢光素酶報(bào)告基因的下游。同時(shí)構(gòu)建了預(yù)測結(jié)合部位突變的陰性對照。野生型pGL3-MAP2K43'UTR載體的螢光素酶活性明顯降低，而突變型的螢光素酶活性則無明顯降低。同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑或陰性對照+野生型pGL3-MAP2K43'UTR載體到M

7、G63細(xì)胞抑制miR-27a增加螢光素酶活性。
　　2.抑制miR-27a后可以抑制MG63的增殖MTT檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，miR-27a抑制劑較陰性對照組可以顯著抑制MG63細(xì)胞的增殖。MG63細(xì)胞所形成的集落較陰性對照組少了39.6％。
　　3.抑制miR-27a后可以抑制MG63細(xì)胞的遷移和侵襲能力小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染了miR-27a抑制劑后MG63的轉(zhuǎn)移和侵襲能力分別減少了63.5％和69.1％。
　

8、　4.抑制MG63中miR-27a后能增加激活JNK/p38信號(hào)通路將miR-27a抑制劑或陰性對照轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑的MG63細(xì)胞中MAP2K4蛋白表達(dá)水平提高的同時(shí)，JNK1和p38的磷酸化水平也分別上升了25％和29％。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)MAP2K4是miR-27a的功能靶基因，抑制骨肉瘤細(xì)胞中的miR-27a可以提高M(jìn)AP2K4的蛋白表達(dá)水平，通過激活JNK/p38信號(hào)通路抑