2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分MicroRNA-101在人骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化
  目的:探討人骨肉瘤組織和細(xì)胞中miRNA-101的表達(dá)變化及臨床意義。
  方法:收集華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院骨科骨腫瘤組織庫31例人骨肉瘤組織標(biāo)本和31例非髖關(guān)節(jié)腫瘤疾病行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后的正常骨組織標(biāo)本(骨膜組織),應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測31例人骨肉瘤組織標(biāo)本和31例正常骨組織標(biāo)本的miRNA-101表達(dá)變化;同時應(yīng)用qRT-

2、PCR方法檢測人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)變化。
  結(jié)果:MiRNA-101在31例骨肉瘤組織和正常骨組織中的均有表達(dá),骨肉瘤組織中miRNA-101的表達(dá)顯著低于正常骨組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);MiRNA-101在人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞中同樣有表達(dá),且成骨細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)顯

3、著高于骨肉瘤細(xì)胞MG63和骨肉瘤細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而骨肉瘤細(xì)胞MG63和Saos-2中miRNA-101的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。
  結(jié)論:與正常骨組織及成骨細(xì)胞相比,骨肉瘤組織及骨肉瘤細(xì)胞中miRNA-101的表達(dá)顯著減低,miRNA-101可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。
  第二部分 MicroRNA-101對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響體外實驗研究
  目的:探討miRNA-101對人骨肉瘤細(xì)胞增殖

4、、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲以及遷移等的生物學(xué)特性的影響。
  方法:以LipofectamineTM2000為載體,將miRNA-101模擬物及miRNA-101陰性對照模擬物瞬時轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞中。實驗分組設(shè)計成三組分別為空白對照組、模擬物陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,實時熒光定量PCR檢測三組細(xì)胞miRNA-101的表達(dá),MTT法檢測不同時間點三組細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞

5、儀檢測三組細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期變化,Transwell實驗和劃痕實驗分別檢測三組細(xì)胞的侵襲及遷移能力。
  結(jié)果:瞬時轉(zhuǎn)染24h后,通過熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)70%以上的細(xì)胞內(nèi)有熒光分布時此組細(xì)胞可行相關(guān)指標(biāo)檢測。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞,qRT-PCR檢測三組細(xì)胞miRNA-101的RQ值分別是空白對照組(1.31±0.32)、陰性對照組(1.35±0.31)和miRNA-101模擬物組(3.86±0.28)。模擬物

6、轉(zhuǎn)染組miRNA-101的表達(dá)較空白對照組和陰性對照組明顯上調(diào),相應(yīng)增加了2.95倍和2.86倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組相比,miRNA-101表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.87)。MiRNA-101的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào),表明轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG63細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了miRNA-101模擬物。與陰性對照組和空白對照組相比較,miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的增值速率明顯降低,凋亡率增高,細(xì)胞周期停滯

7、在G1期前(細(xì)胞周期阻滯),腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:MiRNA-101可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯。MiRNA-101可能是一種骨肉瘤抑癌基因,參與骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展。
  第三部分 MicroRNA-101靶基因的預(yù)測及驗證實驗研究
  目的:探尋miRNA-101調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性改變的可能靶基因,分析miR

8、NA-101發(fā)揮調(diào)控作用的可能機制,為深入研究miRNA-101的調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。
  方法:利用TargetScan、miRecord和Pictar等生物信息學(xué)在線網(wǎng)站預(yù)測miRNA-101的靶基因,篩選miRNA-101的候選靶基因。確認(rèn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)為候選靶基因之一,擴增包含候選靶基因
  3'-UTR的基因片段(3'-UTR-mTO

9、R-Wt)并將其亞克隆至熒光素酶報告基因pGL3載體上(pGL3-3'-mTOR-Wt)并對此重組載體進(jìn)行定點突變構(gòu)建為pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut載體。利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miRNA-101與候選靶基因mTOR的結(jié)合情況,明確其是否為miRNA-101的作用靶基因。實時熒光定量PCR檢測三組細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)以及候選靶基因mTOR在骨肉瘤細(xì)胞空白對照組、模擬物陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組中的m

10、RNA表達(dá)。Western Blot檢測以上三組骨肉瘤細(xì)胞mTOR的蛋白表達(dá),同時應(yīng)用Western Blot檢測三組細(xì)胞即空白組、轉(zhuǎn)染mTOR小干擾RNA(mTOR-siRNA)組以及轉(zhuǎn)染mTOR-siRNA陰性對照組)的mTOR蛋白表達(dá)。
  結(jié)果:靶點分析軟件初步推定mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一。而熒光素酶報告基因也證實了此推定的正確性,在熒光素酶報告基因檢測中,共轉(zhuǎn)染miRNA-101模擬物和pGL3-3'

11、-mTOR-Wt組與共轉(zhuǎn)染陰性對照物和pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut組相比,前組的熒光強度明顯降低,較后者減低了0.46,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MTOR的mRNA表達(dá)量在miRNA-101模擬物組較其它兩組顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western Blot檢測表明,miRNA-101模擬物組mTOR蛋白的表達(dá)較其余兩組減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組mTOR的蛋

12、白表達(dá)最少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  結(jié)論:mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一,miRNA-101可同時抑制mTOR的mRNA及蛋白表達(dá)。MiRNA-101調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變可能是通過調(diào)節(jié)mTOR通路關(guān)鍵分子mTOR而發(fā)揮作用。
  第四部分 MicroRNA-101調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響實驗研究
  目的:探討miRNA-101是否通過調(diào)控哺乳

13、動物雷帕霉素靶蛋白mTOR而影響人骨肉瘤細(xì)胞的增值和凋亡。
  方法:以人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2細(xì)胞為研究對象,實驗設(shè)計為如下幾部分:⑴細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對照組、模擬物miRNA-101陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組。⑵細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對照組、mTOR-siRNA陰性對照組以及mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。⑶細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物
  miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對

14、照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染組。⑷細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。采用MTT法檢測不同時間點以上各組骨肉瘤細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞儀檢測以上各組骨肉瘤細(xì)胞的凋亡變化。
  結(jié)果:在miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組、模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組,人骨肉瘤細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制,而細(xì)胞凋

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