MicroRNA-765調(diào)控APE1提高骨肉瘤化學(xué)治療敏感性機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤(OS)是在兒童及青少年中最常見的骨腫瘤之一?；瘜W(xué)治療是骨肉瘤的主要治療方法。在骨肉瘤中，腫瘤血管生成作用與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與化療敏感性及患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。而治療失敗的重要原因與腫瘤細(xì)胞化療藥物耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此，提高骨肉瘤化學(xué)治療敏感性是延長患者生存期的有效途徑。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1)參與調(diào)控骨肉瘤的化療敏感性，是腫瘤細(xì)胞化療抵抗的重要調(diào)節(jié)基因。在OS中，APE1的表達(dá)通常增高，并且與骨肉瘤血管生

2、成正相關(guān)，與化療藥物敏感性、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。MiRNAs具有抑癌或者促癌的雙重作用，通過作用靶基因參與腫瘤調(diào)控。我們通過miRNA高通量芯片技術(shù)，檢測APE1野生型和穩(wěn)定敲低型的人骨肉瘤HOS細(xì)胞株的差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-765在芯片中上調(diào)顯著（上調(diào)＞5倍），生物信息學(xué)預(yù)測提示miR-765具有APE13'UTR區(qū)的結(jié)合位點。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-765能夠靶向結(jié)合APE1，并抑制APE1的表達(dá)及其DNA損傷修復(fù)能力，提高骨肉

3、瘤化療敏感性。同時發(fā)現(xiàn)miR-765聯(lián)合順鉑不僅抑制APE1，還能顯著抑制血管生成相關(guān)因子VEGF，F(xiàn)GF2、TGFβ及MVD的水平，從而提高骨肉瘤細(xì)胞化學(xué)治療敏感性。在小鼠模型中，miR-765能夠明顯抑制移植瘤的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。臨床資料顯示，miR-765陽性表達(dá)的患者，較陰性表達(dá)的能夠獲得更長的生存期，而APE1陽性表達(dá)的骨肉瘤患者則恰恰相反。綜上所述，目前的數(shù)據(jù)表明miR-765能夠靶向結(jié)合APE1，并抑制其表達(dá)及DNA

4、損傷修復(fù)功能，增強(qiáng)順鉑在骨肉瘤細(xì)胞中的抗血管生成作用，從而提高骨肉瘤化療敏感性，為骨肉瘤研究提供了新的生物標(biāo)記和治療靶標(biāo)。
　　研究目的:
　　1.證實APE1是miR-765下游的直接靶基因，確定二者特異性作用位點;miR-765作用于APE1，抑制其DNA損傷修復(fù)功能，提高骨肉瘤化療敏感性。
　　2.證實miR-765通過抑制APE1，增強(qiáng)順鉑在骨肉瘤細(xì)胞中的抗血管生成作用，提高治療敏感性。
　　研究方法:<

5、br>　　1.收集骨肉瘤患者的臨床資料、組織樣本共43例。
　　2.運用生物信息學(xué)分析、載體構(gòu)建、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?Dual luciferasereport genesystem)以及Western blot驗證APE1是miR-765下游的直接靶基因。
　　3.運用Western blot、CCK-8、γ-H2AX實驗技術(shù)驗證miR-765抑制APE1表達(dá)，降低其DNA損傷修復(fù)能力，提高骨肉瘤細(xì)胞化療敏感性。

6、>　　4.運用RT-PCR、Western blot實驗技術(shù)驗證miR-765聯(lián)合順鉑抑制APE1，VEGF，F(xiàn)GF2，TGFβ的表達(dá);運用Transwell和管狀形成實驗檢測miR-765聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細(xì)胞血管生成能力的影響。
　　5.運用動物模型，檢測miR-765對移植瘤的生長影響;運用免疫組化(IHC)檢測瘤體組織APE1，VEGF，F(xiàn)GF2，TGFβ、CD34表達(dá)情況。
　　6.運用免疫組化(IHC)和原位雜交(

7、ISH)分別檢測人骨肉瘤中APE1及miR-765表達(dá)狀況，評估兩者在骨肉瘤患者中的相關(guān)性，對患者預(yù)后的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.MiR-765在骨肉瘤細(xì)胞中能夠靶向結(jié)合APE1，且與APE1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.MiR-765抑制APE1的DNA損傷修復(fù)能力，提高骨肉瘤順鉑治療敏感性。
　　3.MiR-765聯(lián)合順鉑在骨肉瘤細(xì)胞中，能夠顯著抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑抗血管生成作用。

8、>　　4.小鼠實驗表明，miR-765能夠抑制移植瘤的生長。
　　5.臨床數(shù)據(jù)顯示，miR-765陽性表達(dá)的患者，較陰性表達(dá)的患者能夠獲得更長的生存期，而在APE1陽性表達(dá)的患者中，其生存期小于陰性表達(dá)的患者。
　　研究結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中，miR-765能夠靶向結(jié)合APE1的3'UTR區(qū)，在體內(nèi)、體外均抑制APE1的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù);且miR-765通過對APE1的抑制增強(qiáng)順鉑在骨肉瘤細(xì)胞中