骨橋蛋白和Cdc20對人骨肉瘤細胞侵襲轉移及化療敏感性的影響.pdf

1、骨肉瘤是常見的一種骨惡性腫瘤，患者一般是20歲以下的青少年或兒童，其較早就可遠處轉移，預后十分不理想。隨著新輔助化療技術在骨肉瘤治療中的應用，顯著提高了患者的生存率，但在手術后2～3年內(nèi)仍有將近33％的病人因肺轉移而死。因此，探索骨肉瘤轉移機理并設計出相對應的新的治療方案，可從根本上改進骨肉瘤的預后狀況。
　　目前，隨著人們對于骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)與腫瘤轉移之間關系的深入研究，人們認為骨橋蛋白(Osteopo

2、ntin，OPN)的確調(diào)控著腫瘤轉移。研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中OPN的表達量均升高，而其表達的增高是腫瘤細胞發(fā)生轉移的重要因素，OPN可能是腫瘤遠處轉移和預后的預測因子。同時，針對OPN或其受體的干預，成為防治腫瘤轉移的潛在治療靶點。近年來，人們較多關注OPN在上皮源性惡性腫瘤組織中的表達，而忽略了其在骨肉瘤中的相關作用機制。關于OPN在骨肉瘤轉移中作用，以及利用抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤轉移的實驗研究尚未見報道。本研究探索了骨肉

3、瘤中OPN的表達情況，并闡明了其與骨肉瘤細胞遠端轉移之間的相關性。并以體外建系的人骨肉瘤MG-63細胞系為模型，研究抗OPN特異性抗體對骨肉瘤高轉移細胞系侵襲轉移生物學行為的影響。通過抗OPN特異性抗體聯(lián)合化療藥物作用于骨肉瘤MG-63細胞系，驗證抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤的有效性及協(xié)同化療藥作用的可能性。
　　最近研究報道顯示CDC20(cell division cycle20homologue)在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮

4、重要的致癌作用，在人類多種腫瘤組織和細胞株中，都發(fā)現(xiàn)Cdc20的異常高表達，包括胰腺癌、結腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等，Cdc20的高表達與臨床病理指標具有相關性。但是在骨肉瘤中的作用和機制不是很清楚。
　　目的:
　　采用轉染技術過表達Cdc20和敲除Cdc20后，我們檢測了骨肉瘤細胞株的生長，周期，凋亡，侵襲和遷移，從而推測Cdc20可能是骨肉瘤治療的一個有效靶點。
　　方法:
　　1、以骨肉瘤和骨軟骨瘤為研究

5、對象，應用免疫組化S-P法測定OPN的表達水平，單因素分析OPN的表達水平與骨肉瘤臨床病例特征之間的關系，在分析骨肉瘤細胞遠處轉移時，我們采用多因素回歸分析模型的方法。利用RT-PCR技術分別檢測了骨肉瘤組織與正常骨組織標本中其mRNA表達水平，并分析OPN在不同組內(nèi)表達水平的差異。
　　2、以人骨肉瘤MG-63細胞系為研究對象，抗OPN特異性抗體作用于MG-63細胞系，采用Western blot以及RT-PCR等分子生物學檢測

6、方法分別檢測抗體干擾前后OPN在mRNA和蛋白表達水平上的變化;MTT法檢測MG-63細胞在OPN有無干擾時的增殖變化;通過量效曲線及時效曲線分析其生長抑制作用;平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力;通過細胞劃痕實驗和體外侵襲實驗檢測其對細胞遷徙和侵襲能力的影響。
　　3、選用MTX、ADM、DDP、IFO、VP16、紫杉醇6種藥物，應用抗OPN特異性抗體與化療藥物聯(lián)合作用于骨肉瘤MG-63細胞株，加入不同濃度梯度化療藥物，MTT

7、方法檢測藥物處理0、24、48以及72小時后的吸光值。分析抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤的有效性及與化療藥物的協(xié)同作用。
　　4、以人骨肉瘤MG-63和U2OS細胞系為研究對象，采用Western blot法檢測干擾前后Cdc20蛋白表達水平的變化;CTG法檢測骨肉瘤細胞在Cdc20有無干擾時的增殖變化;通過流式細胞儀方法檢測細胞凋亡和周期的改變;通過細胞劃痕實驗和體外侵襲實驗檢測Cdc20其對細胞遷徙和侵襲能力的影響。
　　

8、5、統(tǒng)計學分析:用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以±s表示，用x2檢驗評估計數(shù)資料，用成組比較t檢驗評估計量資料，所有相關分析都用Spearman和Pearson，檢驗水準α=0.05。
　　結果:
　　1、OPN在骨肉瘤中表達陽性率為76.7％，在骨軟骨瘤中為22.2％，二者間有顯著性差異。通過對OPN與骨肉瘤臨床病理特征相關性進行分析，結果顯示OPN的表達水平主要與肺轉移以及臨床的分期的相關性較為明顯，而與

9、病人的年齡、性別以及病例分型無關。OPN的表達水平會隨著臨床分期程度的增加以及肺轉移的發(fā)生而增高，組間有顯著性差異。利用單因素分析發(fā)現(xiàn)有較多因素與骨肉瘤肺轉移有相關性，例如:ALP水平、新輔助化療、臨床分期、OPN以及腫瘤體積等。在此基礎上利用多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)臨床分期和新輔助化療是兩個有統(tǒng)計學意義的獨立因素。由此構建了Logistic回歸方程。OPN mRNA在骨肉瘤中高表達，在正常骨組織中低表達，兩者OPN mRNA表達量有顯著性差

10、異。
　　2、RT-PCR和Western blot結果證實MG-63細胞中OPN高表達，抗OPN特異性抗體作用于MG-63細胞系結果顯示，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)無明顯改變;隨著抗OPN特異性抗體劑量的增加和作用時間的延長，MG-63細胞中OPN mRNA和蛋白表達下調(diào)。MTT結果提示，隨著抗OPN特異性抗體劑量增加和作用時間延長，MG-63細胞的增殖抑制表現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性。平板克隆形成實驗結果顯示抗OPN特異性抗體明顯

11、抑制細胞克隆的形成;細胞劃痕愈合實驗和Transwell實驗的結果表明，細胞遷徙能力明顯減弱，侵襲能力明顯下降。
　　3、MTT實驗結果表明，經(jīng)過OPN特異性抗體處理后的MG63細胞株對于化療藥物更加敏感，具有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。此外，實驗數(shù)據(jù)表明在同等條件下，化療藥物對于細胞的生長抑制效果與是否經(jīng)過抗體處理具有顯著性差異。說明抗OPN特異性抗體作用下化療藥物對MG-63細胞的敏感性升高。啟示抗OPN特異性抗體本身可優(yōu)化

12、化療藥物對于骨肉瘤的治療效果。
　　4、CTG實驗結果顯示，下調(diào)Cdc20后細胞的增殖減弱。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)下調(diào)Cdc20后細胞的凋亡增加，細胞周期被阻止在G2/M期。劃痕實驗和侵襲實驗結果表明下調(diào)Cdc20后骨肉瘤細胞的遷移和侵襲力減弱。相反，過表達Cdc20后，骨肉瘤細胞的生長加快，凋亡減少，劃痕愈合加快，細胞的侵襲力加強。提示Cdc20在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用。
　　結論:
　　1、OPN在骨肉瘤中高表達，表

13、明OPN與骨肉瘤的惡性生物學行為相關，可能是判斷骨肉瘤惡性程度及預后的指標，提示可作為骨肉瘤轉移的治療標靶。多因素回歸分析結果顯示OPN基因可能通過多種信號通路調(diào)控惡性腫瘤的轉移。OPN基因可作為新指標用于預估腫瘤的預后以及監(jiān)測骨肉瘤的復發(fā)和轉移。
　　2、抗OPN特異性抗體可以下調(diào)MG-63細胞中OPN表達。平板克隆、劃痕實驗、侵襲實驗結果表明，抗OPN特異性抗體可能通過下調(diào)MG-63細胞中OPN的表達，發(fā)揮抑制骨肉瘤侵襲、轉移

14、的作用。以上提示對OPN的干擾可成為骨肉瘤轉移治療的新途徑。
　　3、抗OPN特異性抗體通過下調(diào)OPN，可顯著提升化療藥物對于MG-63細胞系增殖的抑制水平，因此可作為骨肉瘤化療的新途徑，但其機制還需繼續(xù)探索?？筄PN特異性抗體可能會成為一種有前景骨肉瘤治療的新途徑，將會發(fā)揮巨大的臨床應用價值。
　　4、Cdc20敲除可以抑制骨肉瘤細胞生長、誘導細胞凋亡和周期阻滯、減弱細胞侵襲。敲低Cdc20后Bim和p21蛋白水平升高。過