DNA損傷修復(fù)基因APE1 RNA干擾提高骨肉瘤抗血管生成治療敏感性的研究.pdf

1、本項目應(yīng)用免疫組化檢測骨肉瘤中APE1表達(dá)，分析APE1與骨肉瘤演進(jìn)以及血管生成的關(guān)系。并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建人體APE1siRNA表達(dá)載體pSilenceAPE1，“敲除”骨肉瘤細(xì)胞APE1基因的表達(dá)。通過裸鼠荷瘤實驗，荷瘤生長曲線觀察、蛋白印跡和免疫組化等技術(shù)，探討APE1“敲除”骨肉瘤細(xì)胞對抗血管生成治療的反應(yīng)。 研究目的:探討DNA損傷修復(fù)基因APE1在骨肉瘤中的表達(dá)及其與腫瘤演進(jìn)、血管生成及患者預(yù)后的關(guān)系。

2、 構(gòu)建骨肉瘤APE1siRNA表達(dá)載體pSilenceAPE1，并檢測其對HOS和9901骨肉瘤細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)的敲除作用，同時探討其在抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程中的作用。 通過腫瘤生長、病理組織學(xué)、免疫組化以及激光共聚焦等技術(shù)，觀察pSilencedAPE1對ES抗裸鼠骨肉瘤移植瘤血管生成協(xié)同作用。 研究結(jié)果:APE1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系。APE1蛋白在五種骨肉瘤細(xì)胞株呈強(qiáng)陽性表達(dá)，主要定位于腫瘤

3、細(xì)胞的胞核，60例骨肉瘤組織中43例(72％)呈高表達(dá)，17例呈低表達(dá)，且顯著高于正常骨及良性骨瘤(p=0.000)。APE1表達(dá)的程度和預(yù)后密切相關(guān)。APE1強(qiáng)表達(dá)組中的瘤內(nèi)MVD(46.4±26.7)顯著高于弱表達(dá)組(33.3±20.7)(p=0.03)。 APE1siRNA表達(dá)載體構(gòu)建及其對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷徙的抑制作用。通過雙酶切鑒定和測序驗證，成功構(gòu)建了OS的APE1siRNA表達(dá)載體。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染9901和HOS細(xì)胞，

4、免疫印跡試驗驗證pSilenceAPE1載體對OS細(xì)胞APE1基因具有特異性“敲除”作用，其阻斷APE1基因表達(dá)效率為72-95％。Westernblot分析表明siRNA阻斷APE1基因表達(dá)以3.0μg作用2天APE1蛋白受抑最為顯著；用熒光顯微鏡檢測EGFP表達(dá)質(zhì)粒估算RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為28-62％。在APE1基因沉默條件下，骨肉瘤HOS和9901誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷徙能力明顯的降低；TUNEL法觀察到HOS和9901細(xì)胞凋亡增

5、加，細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，而細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著降低。 骨肉瘤細(xì)胞中pSilenceAPE1對ES抗血管生成協(xié)同作用研究9901骨肉瘤細(xì)胞的成瘤率100％，潛伏期3天，生長穩(wěn)定，是研究骨肉瘤生物學(xué)特性的重要模型。瘤內(nèi)注射不同劑量的ES后，所有裸鼠骨肉瘤移植瘤體積隨時間延伸而逐漸縮小，各治療組和正常對照組有顯著差異，低劑量組和高劑量組抑瘤率分別為22.92％和35.83％。正常組、低劑量ES組和高劑量組的增殖指數(shù)、微血管密度和凋

6、亡指數(shù)有明顯差異。用pSilenceAPE1、ES和pSilenceAPE1與ES聯(lián)合治療骨肉瘤裸鼠后發(fā)現(xiàn)，三組的抑瘤率分別為38.23％、35.29％和62.18％；正常對照組、pSilenceAPE1組、ES組和混合組的凋亡指數(shù)分別為2.52±0.24％，7.96±0.58％，8.10±0.34％，18.66±0.69％，微血管密度分別為5.24±1.13％，16.10±0.91％，15.04±0.47％，8.74±0.69％，增殖

7、指數(shù)分別為70.40±2.70％，50.20±4.80％，53.60±6.22％，43.80±1.79％。各治療組的凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組，而增殖指數(shù)和微血管密度明顯低于對照組。其中，混合組微血管密度和增殖指數(shù)明顯低于其他組，凋亡指數(shù)明顯高于其他組。表明，pSilenceAPE1對ES具有協(xié)同效應(yīng)。 結(jié)論:APE1在骨肉瘤中過度表達(dá)與骨肉瘤分化及微血管密度密切相關(guān)。APE1可能參與腫瘤血管生成，針對APE1靶向基因治療可能提

8、高抗血管生成治療敏感性。 pSilenceAPE1可敲除骨肉瘤細(xì)胞APE1基因表達(dá)，APE1蛋白表達(dá)受抑以3.0μg作用2天最為顯著。本研究應(yīng)用RNA干擾手段誘導(dǎo)基因沉默效率達(dá)到72-95％。 pSilenceAPE1和ES均能有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，且pSilenceAPE1對ES的抑制血管內(nèi)皮遷徙作用具有協(xié)同效應(yīng)。 ES抗血管生成治療能顯著抑制骨肉瘤生長，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤的微血管密度，而