APE1在線粒體DNA損傷修復中的作用及其線粒體定位機制的研究.pdf

1、氧化應激與多種病理狀態(tài)密切相關(guān)，包括癌癥，衰老和心血管疾病等。DNA是氧化應激損傷的重要靶分子之一，形成的DNA氧化性損傷主要經(jīng)堿基切除修復(BER)進行修復。APE1為BER途徑的限速酶，其表達水平高低對于BER的活性至關(guān)重要。線粒體是除細胞核外唯一具有基因組DNA的細胞器，由于缺乏組蛋白，蛋白編碼區(qū)密集無內(nèi)含子，加之與電子轉(zhuǎn)運鏈相鄰，mtDNA極易受到氧化應激的損傷，有研究表明正常細胞mtDNA氧化損傷穩(wěn)態(tài)的水平是nDNA的3-15

2、倍。然而，正常細胞mtDNA修復活性較弱，通過基因治療的手段提高mtDNA修復能力成為增強細胞對氧化應激耐受性的新策略。通過外源性上調(diào)多種DNA糖基化酶的線粒體表達水平能有效增強mtDNA的修復活性從而提高哺乳動物細胞在氧化應激條件下的存活率。但是由于糖基化酶的底物特異性高，僅能針對單一損傷進行修復，因此更多的研究集中在作用于BER共同通路的修復酶APE1，希望通過增強其活性達到更為廣泛的修復增強效應。有研究在線粒體中成功過表達全長野生

3、型APE1基因或APE1的同源基因，但卻無顯著的細胞效應或產(chǎn)生與預期截然相反的效應。最近有研究報道線粒體型與全長型APE1相比缺乏N端序列卻具有比全長型APE1更強的DNA修復活性，然而對于APE1這種缺乏典型的MTS的細胞核編碼的基因，其進入線粒體的機制仍未完全明了。因此本研究首先觀察在不同的氧化應激刺激下不同細胞株中APE1的亞細胞分布的改變情況，討論其在氧化應激反應中的生物學效應，然后擬構(gòu)建N端截短型APE1基因的線粒體表達載體增

4、強其線粒體表達，探討其對血管內(nèi)皮細胞mtDNA修復能力的影響，并進一步觀察其對細胞在氧化應激狀態(tài)下凋亡和增殖的影響效應，最后對APE1的線粒體定位信號進行研究，為以線粒體APE1為靶點的基因治療提供理論基礎(chǔ)及可行策略。 研究目的： 1.探討不同的處理因素誘導的氧化應激狀態(tài)下不同細胞中APE1的線粒體轉(zhuǎn)位情況及差異； 2.探討截短型APE1基因線粒體定位表達對人內(nèi)皮細胞在氧化應激后存活和增殖能力的影響； 3

5、.探討APE1線粒體定位信號存在的可能區(qū)域，為進一步研究其線粒體定位機制奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法： 1.氧化應激對APE1亞細胞定位的影響：采用激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標記的APE1在氧化應激后細胞內(nèi)定位的變化，同時提取線粒體組分蛋白證實形態(tài)學觀察。分析氧化應激對APE1亞細胞定位的影響及與不同細胞直接變化的差異，為進一步以線粒體APE1為靶點的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 2.截短型APE1線粒體定位表達載體的

6、構(gòu)建及其生物學效應：以真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為載體，首先通過PCR得到MTS和ND_APE1序列，而后經(jīng)過SOE得到拼接的基因，與線性化pcDNA3.1(+)質(zhì)粒連接后構(gòu)建pcDNA-mtAPE1-HA，經(jīng)測序鑒定。采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pcDNA-mtAPE1-HA后的亞細胞定位；Westernblot和APE活性分析檢測其對HUVE細胞線粒體APE1水平和mtDNA修復能力的增強作用；利用MTT和克隆形成實驗檢測氧

7、化應激后的細胞存活和增殖能力，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，并用Westernblot檢測細胞色素C的胞漿釋放。 3.APE1線粒體定位信號的研究：構(gòu)建C端帶有EGFP和HA標簽的不同長度的截短型APE1融合蛋白，用激光共聚焦觀察細胞內(nèi)的分布情況推測其線粒體定位信號大致的分布區(qū)域。 研究結(jié)果： 1.氧化應激對APE1亞細胞定位的影響：電離輻射后3小時內(nèi)骨肉瘤細胞中APE1分布由照射前細胞核分布轉(zhuǎn)變?yōu)橐园麧{為主的分布，

8、3小時線粒體APE1增加超過30倍；H2O2處理后3小時內(nèi)血管內(nèi)皮HUVE細胞APE1僅少量轉(zhuǎn)位進入線粒體，3小時內(nèi)線粒體APE1水平增加不超過5倍。 2.截短型APE1線粒體定位表達載體的構(gòu)建及其生物學效應：經(jīng)測序分析表明成功構(gòu)建重組表達載體pcDNA-mtAPE1-HA和對照載體pcDNA-flAPE1-HA。轉(zhuǎn)染HUVE細胞發(fā)現(xiàn)pcDNA-mtAPE1-HA能顯著增加線粒體APE1水平，而pcDNA-flAPE1-HA則明

9、顯增加細胞核APE1水平，兩者均能輕度增加胞漿APE1水平。pcDNA-mtAPE1-HA轉(zhuǎn)染能明顯增加線粒體APE活性，而不增加胞核APE活性；pcDNA-flAPE1-HA則僅能輕度增加胞核APE活性，不增加線粒體APE活性。在不同濃度H2O2誘導的氧化應激后，pcDNA-mtAPE1-HA轉(zhuǎn)染能提高血管內(nèi)皮細胞細胞存活和增殖能力，同時降低細胞凋亡率，而pcDNA-flAPE1-HA與對照組無顯著差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，pcDNA-m

10、tAPE1-HA轉(zhuǎn)染可抑制H2O2處理后細胞色素C的胞漿釋放。 3.APE1線粒體定位信號的研究：帶有EGFP標簽的載體pEGFP-(42-318)-APE1，pEGFP-(60-318)-APE1，pEGFP-(249-318)-APE1和pEGFP-(288-318)-APE1表達的融合蛋白在細胞內(nèi)均出現(xiàn)非特異性全細胞彌散分布，而C端帶有HA標簽的表達載體pEGFP-(42-318)-APE1-HA，pEGFP-(60-31

11、8)-APE1-HA和pEGFP-(249-318)-APE1-HA出現(xiàn)特異性線粒體定位而pEGFP-(288-318)-APE1-HA則為非特異性全細胞彌散分布，由于這種亞細胞分布形式差異發(fā)生于249-288位氨基酸殘基的缺失，因此推測為改區(qū)域可能存在線粒體定位信號。 結(jié)論： 1.在電離輻射處理后早期，骨肉瘤HOS細胞內(nèi)APE1分布由單純細胞核表達向胞漿為主表達轉(zhuǎn)變；而在H2O2處理后早期，血管內(nèi)皮HUVE細胞內(nèi)少量A

12、PE1由細胞核向線粒體轉(zhuǎn)位。氧化應激后早期APE1線粒體轉(zhuǎn)位是普遍現(xiàn)象，但是其程度和速度與不同細胞株對不同的處理因素敏感性差異相關(guān)。 2.通過將線粒體定位序列融合于N端33氨基酸序列缺失的APE1序列并構(gòu)建真核表達載體轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮HUVE細胞中能顯著增強線粒體APE1水平，而全長APE1真核表達載體轉(zhuǎn)染僅能增加細胞核APE1水平。 3.截短型APE1線粒體特異性過表達能顯著增加血管內(nèi)皮細胞在H2O2誘導的氧化應激后細胞

13、存活及其增殖能力，而全長APE1過表達對H2O2誘導的細胞死亡無保護效應。 4.截短型APE1線粒體過表達增加血管內(nèi)皮細胞在氧化應激后細胞存活，是通過阻斷線粒體途徑細胞凋亡實現(xiàn)的。 5.APE1的線粒體定位序列可能存在于C端的249-288位氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)。 6.構(gòu)建帶有蛋白質(zhì)標簽的融合蛋白時，C端的較大的標簽如EGFP很可能影響APE1的線粒體定位序列的暴露，從而干擾其線粒體定位；而小肽標簽如HA則能較好的暴