PNPase調(diào)控MitomiRs對(duì)線粒體DNA氧化損傷的影響.pdf

1、[背景和目的]:線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,其主要功能包括通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,也參與細(xì)胞內(nèi)其它生命活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。線粒體擁有自身的遺傳物質(zhì)-線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。mtDNA中有13個(gè)多肽編碼基因存在,可編碼13個(gè)相關(guān)功能蛋白,這些蛋白可參與合成線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物。mtDNA中還包括了可編碼22個(gè)tRNA以及2個(gè)rRNA的基因。mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制還可能受線粒體microRNA(

2、MitomiRS)的調(diào)控,MitomiRS表達(dá)變化可能導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)及功能的改變。
　　MicroRNAs(microRNAs)長約22至25nt,由核基因組編碼,microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)構(gòu)成基因沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯而發(fā)揮作用。microRNAs在特定的組織(特異性)及特定的發(fā)育階段(時(shí)序性)表達(dá),導(dǎo)致了其在生物體功能中起到的

3、特殊性作用,如microRNA進(jìn)入線粒體后可能會(huì)調(diào)節(jié)mtDNA的表達(dá),而mtDNA的延緩性損害可以延緩細(xì)胞衰老的過程,因此這也提示了microRNA在調(diào)控細(xì)胞以及組織生長發(fā)育發(fā)展過程中有著不可替代的作用。
　　多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide Phosphorylase, PNPase)存在于線粒體膜間隙(intermembrane space,IMS),是一種高度保守的3’—>5’核糖核酸外切酶,依靠磷酸化作用降解

4、RNA。此外,PNPase介導(dǎo)細(xì)胞核編碼的microRNA輸入線粒體。因此推測(cè):調(diào)控PNPase可能導(dǎo)致MitomiRS表達(dá)譜變化,進(jìn)而引起線粒體結(jié)構(gòu)及功能的變化。
　　本研究旨在:①通過shRNA技術(shù)下調(diào)腫瘤細(xì)胞PNPase表達(dá),檢測(cè)線粒體microRNA(MitomiRs)表達(dá)譜的變化。②MitomiRs變化對(duì)線粒體DNA損傷的影響。③采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)差異表達(dá)的MitomiRs的功能。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　1、

5、構(gòu)建PNPase shRNA慢病毒載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染。選取人肝癌細(xì)胞SK-Hep1、Hep G2及人骨肉瘤細(xì)胞U2OS三種細(xì)胞系,將構(gòu)建好的帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中,采用熒光顯微鏡觀測(cè)和western-blot方法檢測(cè)PNPase shRNA效果。
　　2、MitomiRs芯片檢測(cè):抽提目的細(xì)胞線粒體,再提出線粒體RNA,采用miRNA芯片篩選抑制PNPase表達(dá)前后細(xì)胞中差異表達(dá)的MitomiRs,以信號(hào)

6、值>3、2倍法(foldchange=2)作為MitomiRs差異篩選標(biāo)準(zhǔn),GeneSpring GX軟件分析microRNA芯片得到的數(shù)據(jù)。采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system,Q-PCR)檢測(cè)線粒體DNA(mitochondril DNA,mtDNA)的損傷頻率;采用酶聯(lián)免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbent assay

7、,ELISA)檢測(cè)線粒體氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)的變化情況。
　　3、生物信息學(xué)預(yù)測(cè):在TargetScan、miRanda、PicTar、MirTarget2、PITA五個(gè)生物功能信息數(shù)據(jù)庫中同時(shí)對(duì)差異表達(dá)的MitomiRs對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè);同時(shí)在三個(gè)或三個(gè)以上數(shù)據(jù)庫中具有生物學(xué)意義的MitomiRs靶基因納入后續(xù)功能分析;利用DAVID功能注釋基因芯

8、片生物信息學(xué)分析軟件(DAVID Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)預(yù)測(cè)線粒體相關(guān)MitomiRs靶基因(GO分析),以及與這些MitomiRs相關(guān)的信號(hào)通路(Pathway分析)。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　1、采用分子克隆技術(shù)成功地構(gòu)建了PNPase shRNA慢病毒表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染

9、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞SK-Hep1、Hep G2以及人骨肉瘤細(xì)胞U2OS。
　　2、SK-Hep1、HepG2和U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體病毒及PNPase shRNA慢病毒12~24小時(shí)后可見明顯的綠色熒光。當(dāng)MOI(轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù))=20時(shí),3種細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上。連續(xù)觀察1~2周,轉(zhuǎn)染效率仍維持在70%~80%。
　　3、轉(zhuǎn)染PNPase shRNA慢病毒細(xì)胞PNPase表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(p<0.05

10、),而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組PNPase表達(dá)無顯著差異(p>0.05)。
　　4、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase組細(xì)胞線粒體DNA的損傷頻率較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組顯著減少(P<0.05)。
　　5、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase組細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG的檢測(cè)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<

11、0.05)。
　　6、MicroRNA芯片差異篩選結(jié)果顯示(信號(hào)值≥3,foldchange≥2):在SK-Hep1、Hep G2及U2OS三種細(xì)胞系中, sh-PNPase組細(xì)胞表達(dá)下調(diào)的MitomiRs有hsa-miR-3934-5p、hsa-miR-5010-3p、hsa-miR-3154等16個(gè),表達(dá)上調(diào)的MitomiRs有hsa-miR-1973、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-5010-3p等31個(gè)。通過

12、TargetScan等五個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫的同時(shí)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的MitomiRs,如mir-3154、mir-34a-3p、mir-4312、mir-98-3p等涉及的靶基因主要有:CASP(apoptosis-related cysteine peptidase)、CARD(caspase recruitment domain family)、CAAP(caspase activity and apoptosis inhibito

13、r)、AVEN(apoptosis, caspase activation inhibitor)、Fas、FADD(Fas-associated via death domain)等。主要的靶基因功能包括:DNA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗凋亡調(diào)節(jié)、膜穩(wěn)定性等。主要涉及的信號(hào)通路有:細(xì)胞凋亡、ErbB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。這些靶基因可通過Fas—>FADD—>CASP/CARD/CAAP/AVEN—>Mitochondria路徑來保護(hù)