低氧對線粒體自噬的影響及BNIP3介導(dǎo)的調(diào)控作用研究.pdf

1、氧作為細(xì)胞代謝線粒體氧化磷酸化的重要底物，對細(xì)胞的存活具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來越來越多的研究顯示:適度低氧促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活;而嚴(yán)重低氧導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。研究不同低氧條件下細(xì)胞代謝水平的改變，有助于人們更深入地了解機(jī)體對低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞遭受低氧刺激時，因?yàn)榫€粒體電子傳遞鏈中作為電子最終受體的氧分子供應(yīng)不足，導(dǎo)致電子傳遞鏈(ElectronTransport Chain，ETC)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive Oxyge

2、n Species，ROS)，大量產(chǎn)生的活性氧會對細(xì)胞中大分子和細(xì)胞器造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂或細(xì)胞死亡。
　　線粒體自噬(mitophagy)是近年來被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞在多種應(yīng)激刺激下的一種適應(yīng)性代謝反應(yīng)。自噬過去一直被視為細(xì)胞死亡的一種方式，近年來隨著對自噬研究的深入，自噬被發(fā)現(xiàn)作為一種重要的機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)，在機(jī)體應(yīng)對應(yīng)激環(huán)境時行使重要的促存活作用。線粒體自噬作為自噬的一種形式，能通過自噬-溶酶體途徑特異性地降解受損的線粒體，

3、維持細(xì)胞中活性氧的水平，防止細(xì)胞中因?yàn)镽OS、MMP(Mitochondrial Membrane Potential)等造成的線粒體內(nèi)容物的釋放和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡或壞死。因此，線粒體自噬被認(rèn)為在多種應(yīng)激條件下發(fā)揮著重要的促存活作用。近期研究表明，細(xì)胞在低氧條件下能通過激活低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-Inducible Factor1,HIF-1)和BNIP3(Bcl-2 and adenovirus E1B19kDa-inter

4、acting protein3)介導(dǎo)的PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)通路誘導(dǎo)線粒體自噬，減少活性氧ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞的存活和低氧適應(yīng)。
　　BNIP3是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，它是一種線粒體外膜蛋白，也是HIF-1的靶基因。在低氧時能被HIF-1轉(zhuǎn)錄激活，使BNIP3表達(dá)上調(diào)。早期的研究顯示低氧下BNIP3在線粒體途徑的凋亡和壞死中起重要作用。近幾年越來越多的研究證

5、明BNIP3在線粒體自噬中也發(fā)揮著重要作用。因而，關(guān)于低氧下BNIP3的功能探討存在著兩種不同的觀點(diǎn)。
　　在本研究中，我們探討了不同氧濃度下線粒體自噬的發(fā)生;其對細(xì)胞存活的影響，以及BNIP3在不同氧濃度下表達(dá)和對線粒體自噬及細(xì)胞存活的影響。研究中，我們用0.3％ O2和10％ O2為低氧模型，檢測不同氧濃度對PC12細(xì)胞存活與線粒體自噬的影響，并進(jìn)一步探討了BNIP3在不同低氧條件下對線粒體自噬的調(diào)控作用。
　　主要研究

6、結(jié)果如下:
　　1.不同低氧對細(xì)胞存活狀態(tài)的影響
　　我們采用適度低氧(10％ O2，24 h)和嚴(yán)重低氧(0.3％ O2，24 h)兩種低氧模型，通過比較不同氧濃度下細(xì)胞存活率，總抗氧化能力（Total Anti-Oxidantcapacity，T-AOC），活性氧含量，細(xì)胞凋亡和增殖能力，確定適度低氧和嚴(yán)重低氧對細(xì)胞存活狀態(tài)的影響。
　　1.1細(xì)胞存活
　　我們通過MTT實(shí)驗(yàn)比較不同氧濃度，不同低氧處理時間對

7、不同接種密度下PC12細(xì)胞存活能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)10％ O2低氧處理24 h和48 h后存活能力都顯著增加;而0.3％ O2低氧條件下，低氧處理24 h或48 h，均明顯抑制PC12細(xì)胞的存活。
　　1.2總抗氧化能力
　　我們進(jìn)一步通過總抗氧化能力試劑盒檢測了PC12細(xì)胞的總抗氧化能力。結(jié)果顯示:10％O2處理24 h后，細(xì)胞的總抗氧化力較常氧組有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異;0.3％ O2處理24 h后，細(xì)胞的總

8、抗氧化能力較常氧組明顯地降低。
　　1.3活性氧含量
　　此外，我們用熒光標(biāo)記的ROS分子探針孵育細(xì)胞，染色后檢測結(jié)果顯示:與常氧對照相比，10％ O2處理24 h后，細(xì)胞經(jīng)過ROS探針分子染色后熒光強(qiáng)度無顯著變化。0.3％ O2處理24 h后，細(xì)胞經(jīng)過ROS探針分子染色后的熒光強(qiáng)度增加了約2倍。
　　1.4細(xì)胞凋亡
　　由于ROS大量產(chǎn)生是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，我們進(jìn)一步通過TUNEL染色、AnnexinⅤ/

9、PI雙染和Western Blot檢測凋亡標(biāo)記分子caspase-3和caspase-9的剪切活化觀察了不同氧濃度對PC12細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常氧和10％ O2處理24 h后，細(xì)胞的凋亡率較低，而經(jīng)過0.3％ O2處理24 h后，PC12細(xì)胞的凋亡率顯著升高。
　　1.5細(xì)胞增殖
　　不同低氧條件下，除了細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞的存活外，低氧對細(xì)胞增殖的作用也會影響細(xì)胞的存活數(shù)目。因此，我們又進(jìn)一步檢測了不同低氧對細(xì)胞

10、增殖的影響。通過PI染色流式檢測細(xì)胞周期和BrdU摻入法觀察不同氧濃度下PC12細(xì)胞的增殖狀態(tài)。結(jié)果顯示:10％ O2處理24 h后細(xì)胞增殖較常氧無顯著變化，0.3％O2處理24h后細(xì)胞增殖減少。
　　通過上述實(shí)驗(yàn)，我們確定了適度低氧(10％ O2，24 h)和嚴(yán)重低氧(0.3％ O2，24 h)兩種不同低氧模型，PC12細(xì)胞在兩種不同氧濃度下存活狀態(tài)截然不同。
　　2.不同低氧對線粒體自噬的影響及線粒體自噬在細(xì)胞存活狀態(tài)中

11、的作用
　　線粒體自噬是新近報道的低氧條件下減少過量ROS產(chǎn)生的適應(yīng)性代謝反應(yīng)。不同氧濃度對線粒體自噬的發(fā)生有何影響？細(xì)胞對不同低氧刺激的迥異反應(yīng)是否通過對線粒體自噬的不同調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的？為闡明這些問題，我們分別進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.1不同低氧下的線粒體自噬
　　將PC12細(xì)胞進(jìn)行適度低氧(10％ O2)和嚴(yán)重低氧(0.3％O2)處理24小時后，我們用電子顯微鏡、Western Blot和熒光共定位分析等檢測方法

12、，觀察了不同低氧條件對PC12細(xì)胞線粒體自噬的影響。與常氧對照相比，適度低氧促進(jìn)細(xì)胞中線粒體自噬的發(fā)生;而嚴(yán)重低氧后，線粒體自噬明顯減少。
　　2.2抑制線粒體自噬對細(xì)胞存活狀態(tài)的影響
　　為進(jìn)一步確定線粒體自噬在不同低氧中對細(xì)胞存活狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，我們用自噬抑制劑3-MA處理PC12細(xì)胞，然后分別觀察了細(xì)胞存活能力，活性氧含量和細(xì)胞凋亡情況，以鑒別線粒體自噬對細(xì)胞存活狀態(tài)的影響。(1) MTT檢測細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示:在常

13、氧和適度低氧條件下，不同濃度的3-MA處理均能導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低;而在嚴(yán)重低氧條件下，不同濃度的3-MA處理對細(xì)胞存活率的影響均不明顯。(2) ROS探針分子檢測細(xì)胞活性氧含量的結(jié)果顯示:常氧條件下，細(xì)胞經(jīng)過3-MA處理后ROS陽性細(xì)胞的數(shù)量無顯著變化;而在適度低氧條件下，3-MA處理后ROS的陽性細(xì)胞率增加顯著;在嚴(yán)重低氧條件下，3-MA處理后ROS陽性細(xì)胞率也有所增加。(3) TUNEL檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示:常氧條件下，細(xì)胞經(jīng)

14、過3-MA處理后凋亡率并未顯著升高，而在適度低氧和嚴(yán)重低氧條件下，3-MA處理均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多。
　　2.3比較線粒體自噬和凋亡對細(xì)胞存活狀態(tài)的影響
　　適度低氧和嚴(yán)重低氧時PC12細(xì)胞中線粒體自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)生相反，為了明確這兩種低氧條件下細(xì)胞是以促進(jìn)細(xì)胞存活的線粒體自噬為主要途徑，還是促進(jìn)細(xì)胞死亡的凋亡途徑占主導(dǎo)作用？我們同時使用了抑制凋亡途徑的抑制劑Z-VAD和抑制自噬發(fā)生的抑制劑3-MA，分別通過MTT和TUN

15、EL染色觀察了抑制自噬與凋亡后細(xì)胞存活能力的改變情況。結(jié)果顯示:適度低氧條件下，3-MA處理后細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞存活率降低，而Z-VAD處理對細(xì)胞的存活狀態(tài)無顯著影響;在嚴(yán)重低氧條件下，3-MA處理后細(xì)胞凋亡和存活率均無顯著影響，而Z-VAD處理后細(xì)胞的凋亡降低，同時細(xì)胞存活率升高。
　　3.低氧對BNIP3表達(dá)的影響及其對線粒體自噬的調(diào)控作用
　　3.1不同低氧下的BNIP3表達(dá)
　　我們檢測了不同氧濃度處理24 h

16、后BNIP3表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在常氧條件下，BNIP3有少量的表達(dá);適度低氧處理后，BNIP3的表達(dá)顯著升高;而嚴(yán)重低氧處理后，BNIP3的表達(dá)顯著降低。
　　我們進(jìn)一步用real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測了BNIP3 mRNA和蛋白在不同時間點(diǎn)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:適度低氧條件下，BNIP3rnRNA和蛋白水平隨著低氧時間而逐漸增加;嚴(yán)重低氧條件下，BNIP3 mRNA表達(dá)隨著低氧時間明顯增加

17、，而其蛋白表達(dá)卻表現(xiàn)出先升后降的特點(diǎn)，這表明BNIP3蛋白的表達(dá)可能存在翻譯后修飾的調(diào)控。
　　3.2 BNIP3過表達(dá)對線粒體自噬的影響
　　用帶有flag標(biāo)簽的BNIP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，我們通過Western Blot檢測線粒體自噬的標(biāo)記分子，結(jié)果顯示過表達(dá)BNIP3能顯著增加線粒體自噬的發(fā)生。
　　3.3 BNIP3 siRNA對細(xì)胞存活、凋亡和線粒體自噬的影響
　　用BNIP3 siRNA轉(zhuǎn)染PC1

18、2細(xì)胞，我們分別通過MTT、 Western Blot和TUNEL染色檢測了不同低氧條件下BNIP3表達(dá)被抑制后對細(xì)胞存活、凋亡以及線粒體自噬的影響。結(jié)果顯示:適度低氧時，BNIP3 siRNA處理后抑制線粒體自噬的發(fā)生和細(xì)胞存活;而嚴(yán)重低氧時，抑制BNIP3的表達(dá)后，對細(xì)胞存活、凋亡和線粒體自噬無明顯影響。
　　綜上所述，本研究證明了適度低氧條件(10％ O2)下，PC12細(xì)胞通過線粒體自噬清除細(xì)胞中的過量ROS，維持氧化還原平