AKT-mTOR-ULK1介導(dǎo)的自噬在骨保護(hù)素調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收活性中的作用機(jī)制.pdf

1、破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)組成了一對(duì)緊密協(xié)調(diào)的平衡機(jī)制，確保骨組織的健康。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子（RANKL）是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和重吸收最主要的兩種細(xì)胞因子。而骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的生成、活化和骨吸收能力增加骨密度。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞的骨吸收過(guò)程與自噬密切相關(guān)，而自噬在OPG抑制破骨細(xì)胞骨吸收過(guò)程中的作

2、用機(jī)制尚未闡明。本研究以BALB/c小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(BMMs)分化形成的破骨細(xì)胞為研究對(duì)象，自噬抑制劑CQ、激動(dòng)劑RAP和OPG處理后，從OPG對(duì)破骨細(xì)胞自噬的影響，自噬在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收過(guò)程中的作用，及AKT/mTOR/ULK1在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用，三方面闡明AKT/mTOR/ULK1介導(dǎo)的自噬在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收活性中的作用機(jī)制。為臨床應(yīng)用OPG治療骨代謝疾病提供理論依據(jù)。
　　1.OPG對(duì)破

3、骨細(xì)胞自噬的影響
　　為了揭示OPG對(duì)破骨細(xì)胞自噬的影響，本研究通過(guò)添加不同濃度(0、20、40、80 ng/mL)的OPG處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、3、6、12h)，結(jié)合CQ和RAP，研究破骨細(xì)胞自噬小體及自噬流的變化，免疫熒光檢測(cè)MDC和LC3熒光強(qiáng)度，透射電鏡檢測(cè)自噬小體數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40ng/mLOPG作用破骨細(xì)胞3h后，能夠顯著提高細(xì)胞的自噬水平。OPG可以減弱CQ對(duì)破骨細(xì)胞自噬的抑制作用，而RAP與OPG可以顯著增強(qiáng)破骨

4、細(xì)胞的自噬水平;OPG顯著增強(qiáng)了MDC和LC3熒光強(qiáng)度并提升了自噬小體數(shù)量，而CQ抑制了破骨細(xì)胞自噬溶酶體的降解，MDC和LC3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，自噬小體數(shù)量顯著減少，添加RAP促進(jìn)了破骨細(xì)胞的自噬，且OPG可以增強(qiáng)RAP對(duì)自噬的促進(jìn)效果。說(shuō)明，40 ng/mL OPG對(duì)分化至3d的破骨細(xì)胞自噬流有顯著的促進(jìn)作用，并促進(jìn)了破骨細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成。
　　2.自噬在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收中的作用
　　為了闡明自噬在OPG調(diào)控破骨

5、細(xì)胞骨吸收過(guò)程中的作用，本研究通過(guò)自噬抑制劑CQ、激動(dòng)劑RAP處理破骨細(xì)胞，采用xCelligence系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞指數(shù)變化，骨吸收陷窩試驗(yàn)觀察破骨細(xì)胞骨吸收能力變化，熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)組織蛋白酶CathepsinK和抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加OPG和RAP處理80h均能顯著抑制破骨細(xì)胞存活率，添加RAP組后期維持在較低水平;OPG和RAP處理組破骨細(xì)胞骨吸收能

6、力較對(duì)照組顯著下降，而CQ能夠部分減弱OPG對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收能力的抑制作用;RAP使CathepsinK和TRAP基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平顯著升高，而CQ能夠部分抵消OPG對(duì)CathepsinK和TRAP蛋白表達(dá)的抑制作用。說(shuō)明OPG在增強(qiáng)破骨細(xì)胞自噬的同時(shí)顯著降低了其骨重吸收能力。
　　3.AKT/mTORULK1信號(hào)通路在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞自噬中的作用
　　為了探究AKT/mTOR/ULK1信號(hào)通路在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞自噬

7、中的作用，本研究利用Western blotting檢測(cè)AKT、mTOR、ULK1等蛋白的磷酸化水平，免疫熒光檢測(cè)LC3和LAMP2共定位，透射電鏡檢測(cè)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPG能夠劑量依賴性地降低P-AKT和P-mTOR蛋白表達(dá)，上調(diào)P-ULK1蛋白表達(dá)。OPG可以增強(qiáng)PI3K/AKT阻斷劑LY294002對(duì)P-AKT和P-mTOR的抑制作用，同時(shí)增強(qiáng)了RAP對(duì)P-AKT的抑制，促進(jìn)了破骨細(xì)胞的自噬，結(jié)果提示OPG通過(guò)抑制

8、AKT/mTOR通路使破骨細(xì)胞的自噬水平增強(qiáng);OPG可以顯著增強(qiáng)LC3和LAMP2熒光強(qiáng)度，并呈現(xiàn)顯著的共定位，添加自噬抑制劑3-MA可以顯著減弱熒光強(qiáng)度，mTOR抑制劑RAP可以顯著增強(qiáng)自噬水平，表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度增加;OPG減弱了3-MA對(duì)破骨細(xì)胞自噬的抑制，較3-MA單獨(dú)處理組，OPG和3-MA共處理組中自噬溶酶體的數(shù)量顯著增多。說(shuō)明40 ng/mL OPG可以通過(guò)AKT/mTOR/ULK1信號(hào)通路顯著增強(qiáng)分化至3d的破骨細(xì)胞自噬水平