自噬在低濃度地塞米松調控成骨細胞增殖中的作用及機制研究.pdf

1、糖皮質激素由于其在免疫應答、抗毒、抗炎等方面的優(yōu)異表現(xiàn)，在臨床上常用于治療炎性及自身免疫性疾病。但是，長期大劑量使用會導致一系列并發(fā)癥。其引起的激素性骨質疏松是一種常見的骨科疾病，目前已認識到糖皮質激素對成骨細胞的抑制作用是引起激素性骨質疏松的主要原因。然而，作為人體一種正常分泌的激素，糖皮質激素對人體的正常生長發(fā)育和新陳代謝又是必不可少的，同時，對骨骼的正常生理活動具有重要的調節(jié)作用。研究表明，在人體正常生理活動中，糖皮質激素可以促進

2、骨髓基質干細胞向成骨細胞方法分化，促進成骨細胞成熟，進而增加人體的成骨活動。在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)低濃度的糖皮質激素在一定條件下對于小鼠來源的成骨細胞有一定的促進增殖的作用，同時還有研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素可以抑制外周血單核細胞引起的成骨細胞凋亡。然而，對于糖皮質激素引起這兩種截然相反結果的原因，目前還沒有詳細的研究。
　　自噬是真核細胞中高度保守的一種細胞生物學功能，它參與清除降解的蛋白，受損、過量的細胞器及細胞內病原體。自噬存在幾乎所

3、有的細胞中以維持細胞的正常代謝。但是作為一種細胞保護機制，自噬活性在饑餓、應激、感染等狀態(tài)下會大大增加，以抵抗外界的不利因素，從而維持細胞的正常生命活動。然而自噬在糖皮質激素調控成骨細胞過程中的作用目前還存在爭議。一些研究認為糖皮質激素誘導的自噬可以促進成骨細胞凋亡，但是也有研究認為適當?shù)淖允煽梢员Ｗo細胞，避免凋亡。綜上所述，自噬與成骨細胞、糖皮質激素之間的相互關系復雜，研究它們之間的相互關系，對于進一步了解糖皮質激素在成骨細胞調控中的

4、作用及進一步了解激素性骨質疏松的發(fā)病機制具有重要意義。
　　目的:
　　本論文的主要目的是研究在糖皮質激素調節(jié)成骨細胞增殖過程中自噬是否參與并發(fā)揮作用，以及自噬過程中存在的分子機制，為臨床上合理使用糖皮質激素及治療和預防激素性骨質疏松提供新的理論依據(jù)和新的思路。
　　方法:
　　本課題采用有較強增殖能力的人成骨細胞系hFOB1.19細胞作為研究對象。
　　1、以梯度濃度地塞米松(0M、10-4M、10-5M

5、、10-6M、10-7M、10-8M)分別作用hFOB1.19細胞0h、24h、48h、72h，然后分別以MTT法、EdU染色法、Annxin-ⅤFITC/PI雙染流式細胞儀檢測藥物作用后的細胞增殖及凋亡情況。
　　2、為了研究自噬是否參與地塞米松調節(jié)成骨細胞增殖的過程，根據(jù)第一步的實驗結果，將地塞米松(10-8M)和3-MA（5mM）、地塞米松(10-6M)和Rap（3μM）組合后共同作用于成骨細胞，然后仍然以MTT法、EdU染

6、色法、Annxin-ⅤFITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞增殖、凋亡情況，將檢測結果和單獨使用地塞米松的細胞進行比較。
　　3、為進一步研究地塞米松對于hFOB1.19細胞自噬的調節(jié)作用，以濃度為10-8M的地塞米松作用于成骨細胞，然后在加入藥物后的第0h、1h、3h、6h、12h、24h收集細胞，采用Western-blot法檢測自噬相關蛋白beclin1、LC3的表達變化情況。同樣，以濃度為10-6M的地塞米松作用于細胞，然后

7、在加入藥物后的第0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h收集細胞，采用Western-blot法檢測自噬相關蛋白LC3和beclin1的表達變化情況。根據(jù)上述實驗結果，分別以0M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M的地塞米松分別作用成骨細胞6h，然后采用Western-blot法檢測自噬相關蛋白LC3和beclin1的表達變化情況。最后，將地塞米松(10-8M)和3-MA(5mM)、地塞米松(10-6M

8、)和Rap（3μM）共同作用于成骨細胞，Western-blot法檢測自噬相關蛋白beclin1、LC3的表達變化情況，將結果同單獨使用地塞米松的分組進行比較。
　　4、將細胞分為對照組、地塞米松組(10-8M)，地塞米松+3-MA(5mM)，藥物孵育6小時后，分別以透射電鏡技術和免疫熒光技術觀察細胞內自噬小體的數(shù)量。
　　5、以不同濃度的地塞米松（0M、10-4M、10-6M、10-8M）作用于細胞6小時，分別用流式細胞術

9、和熒光顯微鏡技術檢測細胞內ROS表達水平，檢驗細胞內ROS水平與地塞米松的關系。
　　6、為研究ROS在地塞米松誘導成骨細胞自噬中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松和ROS清除劑catalase(500U/ml)共同作用于hFOB1.19細胞6小時，另外一組只用地塞米松，然后以western blot法檢測自噬相關蛋白LC3、beclin1。同時，為研究ROS對SIRT1/FOXO3A信號通路的作用，采用western blot

10、法檢測SIRT1和FOXO3A蛋白在hFOB1.19細胞中的表達變化情況。
　　7、為研究SIRT1/FOXO3A信號通路在地塞米松誘導成骨細胞自噬中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松與SIRT1抑制劑sirtinol(5μM)共同作用于hFOB1.19細胞6小時，然后以western blot法檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin1的變化。
　　8、為了進一步驗證ROS/SIRT1/FOXO3A信號通路在低濃度地塞米松調

11、節(jié)成骨細胞活增殖中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松作用于hFOB1.19細胞，同時分別給予catalase(500U/ml)、sirtinol(5μM)、3-MA(5mM)共培養(yǎng)，6小時后，以MTT法和EdU染色法檢測各組細胞增殖活性。
　　結果:
　　1、地塞米松對成骨細胞的調節(jié)作用具有兩面性，低濃度地塞米松可以在短時間內輕度地促進細胞增殖、降低細胞凋亡率，高濃度的地塞米松則持續(xù)地抑制細胞增殖、增加細胞凋亡率。

12、　　2、使用3-MA可以阻斷低濃度地塞米松對成骨細胞增殖能力的促進作用，使細胞凋亡率上升;而Rap可改善地塞米松對成骨細胞活性的抑制作用，降低凋亡率。
　　3、地塞米松可以增加成骨細胞中LC3及beclin1的表達量，并且具有時間依賴和濃度依賴的特點。高濃度地塞米松(10-6M)在作用的第1小時即可使LC3及beclin1的表達量達到較高的水平，此后逐漸下降，而在低濃度地塞米松(10-8M)組，LC3及beclin1的表達量逐漸上

13、升，在第6小時達到最高水平，然后逐漸下降。在第6小時觀察不同濃度地塞米松對自噬水平的影響可以發(fā)現(xiàn)，10-8M地塞米松引起的LC3和beclin1水平上升最明顯，不管是隨著地塞米松濃度的逐漸升高還是逐漸降低，LC3和beclin1的表達量都呈逐漸降低的趨勢。加入自噬抑制劑3-MA后，低濃度地塞米松(10-8M)對自噬的促進作用被抑制，而加入自噬激動劑Rap后，則明顯提高了自噬的強度。
　　4、地塞米松可以顯著增加細胞內自噬小體的數(shù)量

14、，增加細胞內LC3點簇狀聚集的數(shù)量，地塞米松這種增加細胞內自噬小體數(shù)量的作用可以被3-MA阻斷。
　　5、與對照組相比，地塞米松可以上調細胞內ROS的含量，地塞米松濃度越高，其上調ROS含量的能力越強。
　　6、加入ROS清除劑catalase后，自噬相關蛋白LC3和beclin1的表達量與單獨使用地塞米松組相比明顯降低。同時，catalase還可以使SIRT1和FOXO3A蛋白表達量明顯下降。
　　7、SIRT1抑制

15、劑sirtinol可以降低自噬相關蛋白LC3和beclin1的表達量。
　　8、與單獨使用地塞米松相比，catalase和sirtinol都顯著降低了成骨細胞的增殖率，其作用效果與3-MA相似。
　　結論:
　　1、地塞米松對成骨細胞增殖能力的調節(jié)具有兩面性，低濃度地塞米松可以在短時間內輕度地促進成骨細胞增殖，而高濃度地塞米松則可持續(xù)促進成骨細胞凋亡，抑制細胞增殖。自噬參與地塞米松調節(jié)成骨細胞增殖的過程。
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