自噬在低濃度地塞米松調(diào)控成骨細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素由于其在免疫應(yīng)答、抗毒、抗炎等方面的優(yōu)異表現(xiàn)，在臨床上常用于治療炎性及自身免疫性疾病。但是，長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)導(dǎo)致一系列并發(fā)癥。其引起的激素性骨質(zhì)疏松是一種常見的骨科疾病，目前已認(rèn)識(shí)到糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用是引起激素性骨質(zhì)疏松的主要原因。然而，作為人體一種正常分泌的激素，糖皮質(zhì)激素對(duì)人體的正常生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝又是必不可少的，同時(shí)，對(duì)骨骼的正常生理活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，在人體正常生理活動(dòng)中，糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)

2、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方法分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，進(jìn)而增加人體的成骨活動(dòng)。在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)低濃度的糖皮質(zhì)激素在一定條件下對(duì)于小鼠來(lái)源的成骨細(xì)胞有一定的促進(jìn)增殖的作用，同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以抑制外周血單核細(xì)胞引起的成骨細(xì)胞凋亡。然而，對(duì)于糖皮質(zhì)激素引起這兩種截然相反結(jié)果的原因，目前還沒有詳細(xì)的研究。
　　自噬是真核細(xì)胞中高度保守的一種細(xì)胞生物學(xué)功能，它參與清除降解的蛋白，受損、過(guò)量的細(xì)胞器及細(xì)胞內(nèi)病原體。自噬存在幾乎所

3、有的細(xì)胞中以維持細(xì)胞的正常代謝。但是作為一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，自噬活性在饑餓、應(yīng)激、感染等狀態(tài)下會(huì)大大增加，以抵抗外界的不利因素，從而維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)。然而自噬在糖皮質(zhì)激素調(diào)控成骨細(xì)胞過(guò)程中的作用目前還存在爭(zhēng)議。一些研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的自噬可以促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，但是也有研究認(rèn)為適當(dāng)?shù)淖允煽梢员Ｗo(hù)細(xì)胞，避免凋亡。綜上所述，自噬與成骨細(xì)胞、糖皮質(zhì)激素之間的相互關(guān)系復(fù)雜，研究它們之間的相互關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步了解糖皮質(zhì)激素在成骨細(xì)胞調(diào)控中的

4、作用及進(jìn)一步了解激素性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
　　目的:
　　本論文的主要目的是研究在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖過(guò)程中自噬是否參與并發(fā)揮作用，以及自噬過(guò)程中存在的分子機(jī)制，為臨床上合理使用糖皮質(zhì)激素及治療和預(yù)防激素性骨質(zhì)疏松提供新的理論依據(jù)和新的思路。
　　方法:
　　本課題采用有較強(qiáng)增殖能力的人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞作為研究對(duì)象。
　　1、以梯度濃度地塞米松(0M、10-4M、10-5M

5、、10-6M、10-7M、10-8M)分別作用hFOB1.19細(xì)胞0h、24h、48h、72h，然后分別以MTT法、EdU染色法、Annxin-ⅤFITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞增殖及凋亡情況。
　　2、為了研究自噬是否參與地塞米松調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖的過(guò)程，根據(jù)第一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將地塞米松(10-8M)和3-MA（5mM）、地塞米松(10-6M)和Rap（3μM）組合后共同作用于成骨細(xì)胞，然后仍然以MTT法、EdU染

6、色法、Annxin-ⅤFITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡情況，將檢測(cè)結(jié)果和單獨(dú)使用地塞米松的細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　3、為進(jìn)一步研究地塞米松對(duì)于hFOB1.19細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，以濃度為10-8M的地塞米松作用于成骨細(xì)胞，然后在加入藥物后的第0h、1h、3h、6h、12h、24h收集細(xì)胞，采用Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3的表達(dá)變化情況。同樣，以濃度為10-6M的地塞米松作用于細(xì)胞，然后

7、在加入藥物后的第0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h收集細(xì)胞，采用Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin1的表達(dá)變化情況。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以0M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M的地塞米松分別作用成骨細(xì)胞6h，然后采用Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin1的表達(dá)變化情況。最后，將地塞米松(10-8M)和3-MA(5mM)、地塞米松(10-6M

8、)和Rap（3μM）共同作用于成骨細(xì)胞，Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3的表達(dá)變化情況，將結(jié)果同單獨(dú)使用地塞米松的分組進(jìn)行比較。
　　4、將細(xì)胞分為對(duì)照組、地塞米松組(10-8M)，地塞米松+3-MA(5mM)，藥物孵育6小時(shí)后，分別以透射電鏡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量。
　　5、以不同濃度的地塞米松（0M、10-4M、10-6M、10-8M）作用于細(xì)胞6小時(shí)，分別用流式細(xì)胞術(shù)

9、和熒光顯微鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平，檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平與地塞米松的關(guān)系。
　　6、為研究ROS在地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松和ROS清除劑catalase(500U/ml)共同作用于hFOB1.19細(xì)胞6小時(shí)，另外一組只用地塞米松，然后以western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin1。同時(shí)，為研究ROS對(duì)SIRT1/FOXO3A信號(hào)通路的作用，采用western blot

10、法檢測(cè)SIRT1和FOXO3A蛋白在hFOB1.19細(xì)胞中的表達(dá)變化情況。
　　7、為研究SIRT1/FOXO3A信號(hào)通路在地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松與SIRT1抑制劑sirtinol(5μM)共同作用于hFOB1.19細(xì)胞6小時(shí)，然后以western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的變化。
　　8、為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROS/SIRT1/FOXO3A信號(hào)通路在低濃度地塞米松調(diào)

11、節(jié)成骨細(xì)胞活增殖中的作用，用濃度為10-8M的地塞米松作用于hFOB1.19細(xì)胞，同時(shí)分別給予catalase(500U/ml)、sirtinol(5μM)、3-MA(5mM)共培養(yǎng)，6小時(shí)后，以MTT法和EdU染色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果:
　　1、地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用具有兩面性，低濃度地塞米松可以在短時(shí)間內(nèi)輕度地促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞凋亡率，高濃度的地塞米松則持續(xù)地抑制細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡率。

12、　　2、使用3-MA可以阻斷低濃度地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用，使細(xì)胞凋亡率上升;而Rap可改善地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞活性的抑制作用，降低凋亡率。
　　3、地塞米松可以增加成骨細(xì)胞中LC3及beclin1的表達(dá)量，并且具有時(shí)間依賴和濃度依賴的特點(diǎn)。高濃度地塞米松(10-6M)在作用的第1小時(shí)即可使LC3及beclin1的表達(dá)量達(dá)到較高的水平，此后逐漸下降，而在低濃度地塞米松(10-8M)組，LC3及beclin1的表達(dá)量逐漸上

13、升，在第6小時(shí)達(dá)到最高水平，然后逐漸下降。在第6小時(shí)觀察不同濃度地塞米松對(duì)自噬水平的影響可以發(fā)現(xiàn)，10-8M地塞米松引起的LC3和beclin1水平上升最明顯，不管是隨著地塞米松濃度的逐漸升高還是逐漸降低，LC3和beclin1的表達(dá)量都呈逐漸降低的趨勢(shì)。加入自噬抑制劑3-MA后，低濃度地塞米松(10-8M)對(duì)自噬的促進(jìn)作用被抑制，而加入自噬激動(dòng)劑Rap后，則明顯提高了自噬的強(qiáng)度。
　　4、地塞米松可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量

14、，增加細(xì)胞內(nèi)LC3點(diǎn)簇狀聚集的數(shù)量，地塞米松這種增加細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量的作用可以被3-MA阻斷。
　　5、與對(duì)照組相比，地塞米松可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，地塞米松濃度越高，其上調(diào)ROS含量的能力越強(qiáng)。
　　6、加入ROS清除劑catalase后，自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin1的表達(dá)量與單獨(dú)使用地塞米松組相比明顯降低。同時(shí)，catalase還可以使SIRT1和FOXO3A蛋白表達(dá)量明顯下降。
　　7、SIRT1抑制

15、劑sirtinol可以降低自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin1的表達(dá)量。
　　8、與單獨(dú)使用地塞米松相比，catalase和sirtinol都顯著降低了成骨細(xì)胞的增殖率，其作用效果與3-MA相似。
　　結(jié)論:
　　1、地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié)具有兩面性，低濃度地塞米松可以在短時(shí)間內(nèi)輕度地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而高濃度地塞米松則可持續(xù)促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。自噬參與地塞米松調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖的過(guò)程。
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