魚卵唾液酸糖蛋白調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化及作用機(jī)制的研究.pdf

1、正常成年人的骨代謝是一個動態(tài)平衡的過程,包括成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨形成和破骨細(xì)胞進(jìn)行的骨吸收。當(dāng)此平衡失調(diào),骨吸收大于骨形成時,即導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。魚卵中含有豐富的蛋白質(zhì)、EPA、DHA、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,具有防治心血管疾病、改善學(xué)習(xí)能力、促進(jìn)兒童的生長發(fā)育等多種功效。魚卵作為主要加工副產(chǎn)物,對其研究主要集中于其功能脂質(zhì)的開發(fā)和利用,且對魚卵糖蛋白的研究還集中于其分離純化、生化特性等方面,對其活性研究甚少。因此本實驗從鯽魚魚卵中經(jīng)脫脂、水

2、提獲得水溶性唾液酸糖蛋白,從細(xì)胞水平系統(tǒng)的研究了鯽魚卵唾液酸糖蛋白(Carassius auratus sialyglycoproteins,Ca-SGP)促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收功能的作用及機(jī)制,主要研究結(jié)果如下:
　　采用 DAD/FLD串聯(lián) HPLC法檢測不同水產(chǎn)動物水溶性糖蛋白的唾液酸含量,并用 MC3T3-E1成骨細(xì)胞對其增殖活性進(jìn)行追蹤。結(jié)果顯示,不同水產(chǎn)動物卵水溶性糖蛋白唾液酸含量與其促進(jìn) MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增

3、殖活性呈正相關(guān)關(guān)系,無脊椎動物魷魚卵中不含唾液酸,其水溶性糖蛋白對 MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖沒有影響。其中鯽魚卵水溶性糖蛋白中唾液酸含量最高,達(dá)3.76％,其促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖率也最大,400μg/mL時達(dá)153.57%,具有時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。故后續(xù)實驗以鯽魚卵唾液酸糖蛋白為研究對象。
　　為了探究鯽魚卵唾液酸糖蛋白對 MC3T3-E1成骨細(xì)胞活性的影響及其作用機(jī)制,本文將鯽魚卵唾液酸糖蛋白經(jīng)截留分子量為10

4、KDa的中空纖維膜超濾分段,得分子量大于10KDa和小于10KDa的兩個鯽魚卵唾液酸糖蛋白,以MC3T3-E1成骨細(xì)胞為研究對象,采用 MTT法研究了不同分子量 Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的生長(96h時增殖率分別為153.57%和137.28%);采用ELISA方法檢測兩種Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的影響,結(jié)果表

5、明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白ALP、OCN和COL I的分泌量,從而促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化;采用茜素紅染色法檢測不同分子量Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞礦化的影響,結(jié)果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均對成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成具有促進(jìn)作用,分別提高了196.41%和158.37%(P<0.01);采用 RT-PCR和 Western blotting法研究了兩

6、種Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞骨形成關(guān)鍵基因BMP-2、OPG和RANKL mRNA和蛋白表達(dá)的影響,其中RANKL和OPG在調(diào)控破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用, RANKL可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,而OPG可阻斷RANKL的促進(jìn)作用,從而抑制破骨細(xì)胞的分化,結(jié)果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著上調(diào)BMP-2和OPG mRNA和蛋白的表達(dá),下調(diào)RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)。提示,Ca-SGP可能是通過提高 OP

7、G/RANKL的比值水平,而達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及骨形成的功能,且Ca-SGP(>10KDa)的效果優(yōu)于Ca-SGP(<10KDa)。
　　為了進(jìn)一步研究鯽魚卵唾液酸糖蛋白對破骨細(xì)胞分化功能的影響及其作用機(jī)制,本文采用M-CSF和RANKL體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞,建立破骨細(xì)胞模型,系統(tǒng)研究Ca-SGP對破骨細(xì)胞增殖和分化的影響并探究其作用機(jī)制。MTT法和LDH試劑盒法實驗結(jié)果表明,兩種Ca-SGP對破骨細(xì)胞前體細(xì)

8、胞及破骨細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性均無顯著性影響;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法及TRAP活性檢測結(jié)果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能夠呈時間劑量依賴性的抑制小鼠骨髓造血細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化,且分化早期抑制作用最強(qiáng);促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量升高可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,ELISA法檢測結(jié)果表明,>10KDa和<10KDa的Ca-SGP可顯著抑制破骨細(xì)胞促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成。提

9、示鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細(xì)胞的分化及促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的作用,且與其細(xì)胞毒性無關(guān)。
　　破骨細(xì)胞分化機(jī)制簡單介紹如下:成骨細(xì)胞分泌的RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合,促進(jìn)TRAF6與其在RANK上的結(jié)合位點結(jié)合,從而促進(jìn)NF-κB、MAPK通路關(guān)鍵基因的激活,進(jìn)而上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子c-fos和NFATc1的表達(dá)水平,此通路被激活后,引起破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵基因TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白

10、酶 K的表達(dá)升高,從而介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化,因此成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞的調(diào)控至關(guān)重要。本實驗研究結(jié)果表明,兩種 Ca-SGP均能抑制破骨細(xì)胞分化通路中TRAF6、NF-κB、MAPK(p38、ERK、JNK)和核轉(zhuǎn)錄因子c-fos、NFATc1以及TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白酶K的mRNA表達(dá)水平;且TRAF6、c-fos、NFATc1、TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白酶 K的蛋白表達(dá)水平也顯著降低, NF-κB以及MAPK(

11、p38、ERK、JNK)蛋白磷酸化水平也明顯下降。提示Ca-SGP可能通過抑制 NF-κB/MAPK/NFATc1通路基因的表達(dá)而發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化的作用,且與成骨細(xì)胞的調(diào)控息息相關(guān)。
　　綜上所述,鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及骨形成功能、抑制破骨細(xì)胞的分化,其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)MC3T3-E1成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá),下調(diào)RANKL的表達(dá),從而抑制破骨細(xì)胞分化相關(guān)通路NF-κB/MAPK/NFATc1的激活。