兔體外成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞橫向分化的初步研究.pdf

1、目的:探討成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞兩者間橫向分化的能力和方法,為進(jìn)一步行縫隙連接通訊對(duì)其調(diào)控的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 方法:選取3月齡新西蘭大白兔腹股溝處脂肪組織進(jìn)行分離培養(yǎng)脂肪細(xì)胞,天花板貼壁法對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞去分化培養(yǎng),利用第3代去分化脂肪細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。成骨分化指標(biāo)的檢測(cè):對(duì)培養(yǎng)3周后的兩組細(xì)胞進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫組化染色;使用BCIP/NBTALP顯色試劑盒對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行ALP染色;使用ALP活性檢測(cè)試劑盒分

2、別檢測(cè)各組第7天、第14天、第21天細(xì)胞的ALP活性;使用茜素紅對(duì)連續(xù)培養(yǎng)3周的兩組細(xì)胞進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色。取出生7天內(nèi)的乳兔顱骨進(jìn)行成骨細(xì)胞的獲得及培養(yǎng),利用第3代成骨細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo),并設(shè)立對(duì)照組對(duì)比。脂肪細(xì)胞分化指標(biāo)的檢測(cè):兩組細(xì)胞培養(yǎng)3周后行油紅0染色:RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞PPARγmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1、提取的成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)天花板貼壁法培養(yǎng)后形態(tài)為長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞狀。2、成骨分化檢測(cè):Ⅰ型膠原免疫組化染色

3、顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出Ⅰ型膠原,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)段的ALP活性發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組高(p＜0.05);且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組ALP活性逐漸增強(qiáng)(組內(nèi)p＜0.05),與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);經(jīng)BCIP/NBTALP染色試劑盒檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色有棕黑色細(xì)微顆粒,多數(shù)分布在細(xì)胞膜上以及周圍,對(duì)照組細(xì)胞染色無棕黑色顆粒出現(xiàn):茜素紅對(duì)連續(xù)培養(yǎng)3周的兩組細(xì)胞進(jìn)行

4、鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組有較多橘紅色結(jié)節(jié),而對(duì)照組無明顯發(fā)現(xiàn)。3、對(duì)提取的乳兔顱骨原代細(xì)胞茜素紅染色后證實(shí)提取的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。4、成脂檢測(cè)指標(biāo):油紅0染色顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒,對(duì)照組細(xì)胞未被紅染;RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞PPARγmRNA的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組可見有PPARγmRNA表達(dá),而對(duì)照組無PPARγmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論:成熟脂肪細(xì)胞可以通過體外天花板培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)去分化,去分化的脂肪細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下可以向成骨細(xì)