增強(qiáng)或減弱GJIC對(duì)免脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞橫向分化的影響.pdf

1、目的：通過縫隙連接通訊(gap junction intracellular communication，GJIC)增強(qiáng)劑前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)或GJIC減弱劑18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid，18α-GA)對(duì)脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞橫向分化的影響，探討縫隙連接通訊對(duì)脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞間橫向分化的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：①選取3月齡新西蘭大白兔腹股溝處脂肪組織，機(jī)械分

2、離和酶消化法分離提取成熟脂肪細(xì)胞(Mature adipocytes，MA)。②采用天花板貼壁法(即培養(yǎng)瓶內(nèi)充滿培養(yǎng)基，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上)獲得去分化脂肪細(xì)胞(Dedifferentiatedadipocytes，DA)，對(duì)DA進(jìn)行傳代培養(yǎng)。③取第三代去分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)(成骨誘導(dǎo)劑：10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，10mmol/Lβ甘油磷酸鈉，0.05mmol/L維生素C和100mmol/L地塞米松)，加入GJIC增強(qiáng)劑PGE

3、2設(shè)為增強(qiáng)組，加入GJIC減弱劑18α-GA設(shè)為減弱組，并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算倍增時(shí)間，觀察PGE2和18α-GA對(duì)細(xì)胞倍增是否有影響。④成骨分化指標(biāo)的檢測：對(duì)誘導(dǎo)2周的三組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色對(duì)成骨細(xì)胞定性檢測；對(duì)誘導(dǎo)2周后的三組細(xì)胞進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫組化染色對(duì)成骨細(xì)胞半定量檢測。⑤縫隙連接指標(biāo)的檢測：Western blot(蛋白質(zhì)印跡)技術(shù)檢測縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)；劃痕標(biāo)記染料示蹤法(

4、scrape-loading and dye transfer，SLDT)對(duì)各組細(xì)胞GJIC功能檢測；透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察縫隙連接結(jié)構(gòu)并測量縫隙連接的長度。
　　 結(jié)果：①原代成熟脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)小圓形指環(huán)狀，形態(tài)規(guī)則，呈聚集分布。②天花板貼壁法培養(yǎng)MA，在缺氧缺營養(yǎng)環(huán)境下，MA中脂滴逐漸由胞質(zhì)內(nèi)脫出，由圓形逐漸變成橢圓形，最終呈長梭形成纖維細(xì)胞狀的DA。③MTT法

5、繪制細(xì)胞的生長曲線，計(jì)算倍增時(shí)間，組間進(jìn)行單因素方差分析P=0.982(P>0.05)，差異無顯著性意義，說明PGE2、18α-GA對(duì)去分化脂肪細(xì)胞生長增殖無顯著影響。④成骨分化檢測：茜素紅對(duì)連續(xù)培養(yǎng)2周的三組細(xì)胞進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色均發(fā)現(xiàn)紫紅色結(jié)節(jié)；Ⅰ型膠原免疫組化染色灰度值檢測，x±S分別是增強(qiáng)組115.804±8.476、對(duì)照組125.479±9.230、減弱組134.551±7.301，分別與對(duì)照組比較P值分別是0.046、0.047

6、，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。⑤透射電鏡觀察縫隙連接并測量其長度，x±S分別是增強(qiáng)組2.705±0.109、對(duì)照組1.954±0.144、減弱組1.264±0.202，分別與對(duì)照組比較(P均=0)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SLDT法對(duì)各組細(xì)胞GJIC功能檢測發(fā)現(xiàn)LY擴(kuò)散層數(shù)增強(qiáng)組9-10層、對(duì)照組7-8層、減弱組4-5層；Western blot技術(shù)檢測Cx43蛋白的表達(dá)，所得X光膠片用Chemi Imager5500 V2.0軟件掃描，通過F

7、luor Chen2.0軟件進(jìn)行定量分析，測得整合光密度值(integrated density value，IDV)，x±S分別是增強(qiáng)組54826.69±1909.12、對(duì)照組48519.19±1678.50、減弱組44158.92±1356.94，分別與對(duì)照組比較P值分別是0和0.001，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 結(jié)論：天花板貼壁法可以使成熟脂肪細(xì)胞去分化得到去分化脂肪細(xì)胞；去分化的脂肪細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下可以