去分化脂肪細(xì)胞向起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、目前治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征、房室傳導(dǎo)阻滯等緩慢型心率失常的主要方法仍是安裝電子心臟起搏器，但電子心臟起搏器存在的諸多缺陷限制了它的應(yīng)用，因此心臟生物起搏器構(gòu)建已經(jīng)成為生物起搏研究的熱點(diǎn)。
　　 當(dāng)前心臟生物起搏器的構(gòu)建方法主要有基因治療、細(xì)胞移植和組織工程化構(gòu)建等方法?；蛑委煷嬖谕庠椿螂y以在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)和有效調(diào)控，缺乏高效、安全、導(dǎo)向性好的載體等問題。細(xì)胞移植和組織工程化構(gòu)建可以較好的避免基因轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn)。細(xì)胞移植和組織工程

2、化構(gòu)建都涉及到種子細(xì)胞的問題。
　　 目前用于心臟生物起搏器研究較多的種子細(xì)胞為：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)、心臟來源的細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)等，這些種子細(xì)胞都存在一定的缺陷，因此尋找更合適的種子細(xì)胞仍是

3、心臟生物起搏器構(gòu)建的瓶頸問題。
　　 去分化脂肪(dedifferentation fat，DFAT)細(xì)胞由于其易獲得、多向分化潛能及自體可取得優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)引起許多研究學(xué)者的注意。DFAT細(xì)胞是由成熟脂肪細(xì)胞逐漸脫脂去分化而成，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型，而且具有多向分化潛能，在體外可以分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。
　　 Jumabay等在對(duì)小鼠DFAT細(xì)胞給予20％胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，出現(xiàn)一些

4、自發(fā)跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞，具有起搏細(xì)胞的4期自動(dòng)除極化的電生理特征，為構(gòu)建心臟生物起搏器帶來了新的希望。但是由于小鼠心臟太小，難以進(jìn)行心臟生物起搏器的在體研究。因此，有必要對(duì)更大型動(dòng)物進(jìn)行研究。但用與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)等方法誘導(dǎo)大鼠DFAT細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞的表面標(biāo)志，有肌管樣結(jié)構(gòu)形成，可并未觀察到有細(xì)胞具有自主搏動(dòng)。因此，能否將大鼠等來源的DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)為起搏細(xì)胞還需要進(jìn)一步的探討。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬選用大鼠來源的DFAT細(xì)胞為種

5、子細(xì)胞，采用5-AZA誘導(dǎo)和與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，探討能否在體外誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞分化為起搏樣細(xì)胞，旨在為心臟生物起搏器的構(gòu)建提供一種來源廣泛、可來源于自體、無免疫排斥反應(yīng)，且活性好的種子細(xì)胞。
　　 第一部分DFAT細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 研究目的：分離培養(yǎng)獲得大鼠DFAT細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定，以獲取可向起搏樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞。
　　 材料和方法：經(jīng)膠原酶消化獲得的成熟脂肪細(xì)胞，經(jīng)天花板培養(yǎng)法使成熟脂

6、肪細(xì)胞去分化，觀察去分化過程細(xì)胞形態(tài)的變化，用透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。取生長(zhǎng)良好的DFAT細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD13、CD29、CD31、CD34和CD44的表達(dá)情況，并對(duì)DFAT細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化和成骨誘導(dǎo)分化以檢測(cè)DFAT細(xì)胞的多向分化潛能。
　　 結(jié)果：成熟脂肪細(xì)胞可以在天花板培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件下去分化為成纖維樣的DFAT細(xì)胞，透射電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)含豐富的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，說明細(xì)胞具有較高的蛋白合成能力，細(xì)胞活力

7、旺盛。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，DFAT細(xì)胞表達(dá)CD13、CD29、CD44，不表達(dá)CD31和CD34，具有一定的間充質(zhì)干細(xì)特性。體外多向分化潛能結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見紅色脂滴；成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色可見鈣鹽沉積，證明獲得的DFAT細(xì)胞具有多向分化潛能。
　　 結(jié)論：通過天花板培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)了DFAT細(xì)胞。
　　 第二部分5-AZA對(duì)DFAT細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
　　 研究目的：探討5-AZA誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞

8、分化為起搏樣細(xì)胞的可能性。
　　 材料與方法：用10μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞，分別在1周、2周、3周用PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞起搏相關(guān)基因的表達(dá)；在3周時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)起搏相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況；利用與靜息心肌共培養(yǎng)的方法，檢測(cè)其起搏功能。
　　 結(jié)果：DFAT細(xì)胞經(jīng)5-AZA誘導(dǎo)后細(xì)胞變大，突起增多，誘導(dǎo)后3周透射電鏡下可見有肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)和較多的縫隙連接。誘導(dǎo)后細(xì)胞心臟早期標(biāo)志基因Nkx2.5、GATA-4先

9、上調(diào)后下降，Tn、Cx和HCN基因隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸升高，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞可表達(dá)心肌肌鈣蛋白TnT和TnI，縫隙連接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。與靜息心室肌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-AZA誘導(dǎo)的DFAT細(xì)胞并不能驅(qū)動(dòng)靜息的心室肌搏動(dòng)。
　　 結(jié)論：5-AZA可以誘導(dǎo)DFAT分化為具有一定起搏細(xì)胞表型的細(xì)胞，但并不具備起搏細(xì)胞的功能。
　　 第三部分與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)DFAT的誘導(dǎo)

10、分化
　　 研究目的：探討與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞分化為起搏樣細(xì)胞的可能性。
　　 材料與方法：用差速貼壁結(jié)合BrdU法分離新生鼠竇房結(jié)細(xì)胞，再接種于Transwell小室內(nèi)，在6孔培養(yǎng)板中接種DFAT細(xì)胞，最后將Transwell小室插入6孔板中，使DFAT細(xì)胞與竇房結(jié)細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)，分別在1周、2周、3周用PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)；在誘導(dǎo)3周時(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)；利用與靜息心肌共培養(yǎng)的方法

11、，檢測(cè)其起搏功能。
　　 結(jié)果：經(jīng)與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)后，DFAT細(xì)胞逐漸變大，可見肌管樣細(xì)胞，透射電鏡下可見明顯肌節(jié)結(jié)構(gòu)，且存在較豐富的連接，在與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)后細(xì)胞心臟早期標(biāo)志基因Nkx2.5、GATA-4先上調(diào)后下降，Tn、Cx和HCN基因隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸升高，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)心肌肌鈣蛋白TnT和TnI，縫隙連接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。與靜息心室肌共培