體外誘導脂肪來源干細胞向成骨細胞分化的相關研究.pdf

1、骨缺損的修復一直是矯形外科的難題。利用自體骨、異體骨、異種骨、帶血管游離植骨進行修復都存在這樣或那樣的問題。上世紀80年代開始，骨缺損的修復進入了組織工程修復研究的時代。支架材料、生長因子、種子細胞是組織工程的三要素，隨著制造技術的進步，支架材料的研究已取得突飛猛進的進展，已有人工骨應用于臨床。種子細胞是組織工程骨構建和應用研究中的重要環(huán)節(jié)和基本要素，同時也是保證骨組織工程學持續(xù)性深入研究的前提，如何獲取數量充足、功能良好的種子細胞是目

2、前制約組織工程發(fā)展的瓶頸之一。骨髓基質干細胞（bone marrow stem cells， BMSCs）作為骨組織工程種子細胞已經廣泛應用，但是在臨床研究中發(fā)現自骨髓取材獲取細胞數量有限，不能滿足需要，且大量抽取骨髓會增加機體創(chuàng)傷，有一定的并發(fā)癥。 脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發(fā)現ADSCs細胞能夠在體外穩(wěn)定增

3、殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規(guī)模培養(yǎng)，對機體損傷小等優(yōu)點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。構建組織工程骨通常首先要對種子細胞向成骨細胞進行礦化誘導，使其成為具有活性的組織工程細胞，因此，探索ADSCs的最佳礦化條件，使其在最短的時間內成為具有活性的成骨細胞是一個非常有實際意義的課題。 本研究通過在不同誘導條件下使ADSCs向成骨細胞分化，初步摸索

4、其最佳礦化條件，為骨組織工程提供種子細胞。 1 rhBMP-2誘導脂肪來源干細胞向成骨細胞分化的量效作用探討 體外條件下rhBMP-2誘導脂肪來源干細胞向成骨細胞分化和增殖的情況，并觀察其量效關系。從成年兔頸后部獲取脂肪組織，采用酶消化法分離并培養(yǎng)脂肪來源干細胞；穩(wěn)定傳代后，用不同濃度rhBMP-2對ADSCs進行誘導分化，采用堿性磷酸酶染色及I型膠原免疫組化染色進行成骨細胞鑒定，采用堿性磷酸酶活性測定及MTT方法進行分

5、化和增殖活性比較。結果發(fā)現，rhBMP-2誘導ADSCs后堿性磷酸酶及I型膠原免疫組織化學染色為陽性；當rhBMP-2在100－400ng/ml時，各組堿性磷酸酶活性提高明顯（P<0.05），在400ng/ml以上各組則無明顯差別（P>0.05）；當rhBMP-2在800ng/ml以下時，各組增殖活性無明顯差別（P>0.05），在800ng/ml以上則存在明顯的抑制作用，各組存在明顯差別（P<0.05）。研究表明，在體外條件下rhBMP

6、-2能誘導脂肪來源干細胞向成骨細胞分化；并且rhBMP-2濃度在400－800ng/ml時，能促進脂肪來源干細胞的增殖和分化。 2 脂肪來源干細胞向成骨細胞分化的優(yōu)化研究探討 脂肪來源干細胞在不同礦化誘導條件下的生物學特性，優(yōu)化最佳礦化條件。從成年兔頸后部分離并培養(yǎng)出脂肪來源干細胞，穩(wěn)定傳代后，采用普通礦化液誘導組、BMP誘導組、礦化液－BMP聯合誘導組體外誘導兔脂肪成體干細胞，以含10℅小牛血清的DMEM作為對照組，采

7、用堿性磷酸酶染色及I型膠原免疫組化染色進行成骨細胞鑒定，采用堿性磷酸酶活性測定及MTT方法進行分化和增殖活性比較。結果發(fā)現，實驗組堿性磷酸酶及I型膠原免疫組織化學染色為陽性，對照組則為陰性；與對照組相比，實驗組脂肪來源干細胞的增殖均有所抑制，而堿性磷酸酶活性增加，其中礦化液－BMP聯合誘導組產生的成骨細胞表型最為顯著。研究表明，在體外條件下聯合應用礦化液和BMP能在較短時間內有效誘導ADSCs分化為成骨細胞，促進脂肪來源干細胞的分化。

8、 3 年齡對脂肪來源干細胞向成骨細胞分化的影響 觀測年齡因素對脂肪來源干細胞體外向成骨細胞分化能力的影響。對不同年齡（3周、5月、2年）來源的兔脂肪來源干細胞進行分離培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，穩(wěn)定傳代后，采用地賽米松對ADSCs進行成骨誘導分化，通過堿性磷酸酶染色、鈣結節(jié)染色和I型膠原免疫組織化學染色觀察分化情況，通過檢測堿性磷酸酶活性和MTT法比較其成骨能力和分化后的增殖活性。實驗結果顯示，成骨誘導后堿性磷酸酶染色、鈣結節(jié)染色

9、和I型膠原免疫組織化學染色均為陽性，堿性磷酸酶活性及MTT活性檢測顯示各組之間不存在明顯差別，表明不同年齡來源的脂肪來源干細胞在體外的誘導成骨能力無明顯差別。 4 結論 ①本研究成功從兔脂肪組織中分離出脂肪來源干細胞進行體外培養(yǎng)，并能夠在體外穩(wěn)定增殖傳代，在地賽米松和rhBMP-2的誘導下均能夠成功的向成骨細胞分化。 ②rhBMP-2誘導ADSCs的成骨分化存在一定的量效關系，當rhBMP-2在100－400ng

10、/ml時，各組堿性磷酸酶活性提高明顯，在400ng/ml以上各組則無明顯差別；當rhBMP-2在800ng/ml以下時，各組增殖活性無明顯差別，在800ng/ml以上則存在明顯的抑制作用。因此，rhBMP-2濃度在400－800ng/ml時，能促進脂肪來源干細胞的增殖和分化。 ③在體外條件下聯合應用礦化液和BMP能在較短的時間內有效誘導ADSCs分化為成骨細胞，能夠促進脂肪來源干細胞的分化。 ④不同年齡來源的脂肪來源干細