人類脂肪組織來源成體干細胞體外培養(yǎng)的生物特征及轉基因向軟骨細胞誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的:研究人類脂肪組織來源成體干細胞(hADASc)體外分離、培養(yǎng)及表面抗原分子特征；研究人類脂肪組織來源成體干細胞(hADASc)體外培養(yǎng)的生物學特征及供體年齡對其生長增殖的影響；探討將編碼TGF-β1的PGL3-TGFβ1重組質粒轉染人類脂肪組織來源干細胞，細胞通過自分泌作用，定向誘導向軟骨細胞分化的可行性，為進一步“基因加強組織工程學”修復軟骨損傷研究提供一定的體外實驗依據(jù)，從實驗室階段客觀評價其向軟骨細胞定向誘導分化的可行性和能

2、力，為在體研究和臨床研究、應用奠定實驗室研究基礎。 方法： 1．不同年齡組志愿者(<20歲、21～40歲，41～60歲和>61歲，共4個年齡組)，手術切除少量皮下脂肪組織，0．075﹪I型膠原酶37℃酶消化，100run濾網(wǎng)過濾、洗滌，接種在25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，24小時后觀察，予換液棄去原始培養(yǎng)基和漂浮細胞，連續(xù)培養(yǎng)，3天換液一次，細胞融合率達到約80﹪時，1:250胰蛋白酶消化，按照1:2～3比例傳代培養(yǎng)，傳至2

3、0代； 2.取培養(yǎng)第3代細胞，流式細胞儀檢測細胞表面抗原標記物(CD29，CD34，CD44，CD45，CD49d，HLA-DR，CD106)和細胞周期； 3．細胞培養(yǎng)傳20代后進行細胞染色體組分析； 4．MTT。法分別檢測各年齡組不同時間點吸光值，繪制生長曲線，計算人類脂肪來源干細胞倍增時間(Time Doubling，TD)； 5.鑒定PGL3-TGFβ1重組質粒，Kpn I和Nhe I內切酶雙酶切消

4、化，水平分離電泳，DNA測序，Blast軟件在GenBank上進行序列比對鑒定； 6．運用脂質體(FuGENE 6)轉染方法，將PGL3-TGFβ1重組質粒轉染人類脂肪組織來源干細胞，繪制轉染后細胞的生長曲線，檢測Luceferase活性，MTT法(490nm波長)檢測轉染細胞和未轉染細胞的吸光值，評價轉染對細胞生長活力的影響； 7.轉染后人類脂肪組織來源干細胞，進行細胞的TGF-β1基因RT-PCR檢測，以培養(yǎng)的P3代

5、未轉染外源基因的人類脂肪來源干細胞以常規(guī)體外培養(yǎng)為對照組； 8.制備細胞爬片，在培養(yǎng)的第9天，進行抗II型膠原的免疫組織化學染色(SABC法)分析。 結論： 1、結合酶消化法和貼壁篩選法，自少量人類皮下脂肪組織可體外分離培養(yǎng)出具有干細胞特征的有核組織細胞，連續(xù)傳代20代以上遺傳特性穩(wěn)定； 2、供體年齡對人類脂肪組織來源干細胞體外培養(yǎng)生長活力具有一定的影響作用，青年來源細胞生長活力強于老齡供體來源的細胞；

6、 3、hADASc細胞間充質干細胞標志：CD 29(+)CD 44(+)；造血干細胞標記物CD 34(-)和CD 45(-)；成纖維細胞來源標記HLA-DR(-)；CD 106(-)，CD49d(±) 4、脂質體法將PGL3-TGF β1重組基因轉染hADASc，細胞內表達TGF-β1，但對細胞生長活力有一定影響，轉染后細胞生長活性下降； 5、轉染細胞自分泌TGF-β1，連續(xù)培養(yǎng)9天，hADASc表現(xiàn)出軟骨細胞分