大鼠脂肪干細胞的分離培養(yǎng)及向軟骨表型分化的實驗研究.pdf

1、實驗?zāi)康? 探討從大鼠的脂肪組織中分離、培養(yǎng)脂肪干細胞(ADSCs)的方法及鑒定方法。并對在單層培養(yǎng)條件下用外源性轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1定向誘導(dǎo)ADSCs分化為軟骨細胞的可行性進行初步的探討研究。為軟骨組織工程研究中的種子細胞的選擇提供一個新的思路。 實驗方法: Wistar雄性大鼠處死，取腹股溝區(qū)及睪丸脂肪墊等處脂肪組織，清除小血管和結(jié)締組織充分剪碎，加入0.15％的Ⅰ型膠原酶消化，離心后收集細胞置于孵箱中培

2、養(yǎng)。2-3天換液一次去除未貼壁細胞，待貼壁細胞生長融合至80-90％時傳代培養(yǎng)。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察各代ADSCs形態(tài)學(xué)的改變，并用免疫熒光法檢測傳代ADSCs表面抗原CD29表達。取第3代生長良好的脂肪干細胞，分成兩組：一組用含有TGF-β1的培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，另一組為對照組(空白組)用普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)兩周后行ⅠⅠ型膠原免疫組化染色進行檢測鑒定。 結(jié)果: 1、脂肪干細胞的形態(tài)特點：原代培養(yǎng)的脂肪干細胞24小

3、時左右即可見細胞貼壁，多數(shù)貼壁細胞呈小圓形，折光性強，其中散在少量的梭形細胞或多角細胞。3d后梭形細胞逐漸增多，可見核分裂相。5d后細胞呈團簇狀生長，并形成集落。約7d左右細胞融合超過90％時進行傳代，傳代后細胞形態(tài)較為均一，呈長梭形，排列緊密，類似成纖維細胞。 2、脂肪干細胞的鑒定：免疫熒光法檢測脂肪干細胞(ADSCs)。結(jié)果顯示細胞表面抗原CD29呈陽性表達，從而證實所培養(yǎng)細胞為干細胞來源。 3、ADSCs向軟骨細胞

4、的定向分化：實驗組細胞生長速度變慢，誘導(dǎo)第2天即可見少數(shù)單個細胞由梭形變?yōu)槎噙呅?，多角形，可見細長偽足，核周出現(xiàn)黑色顆粒，隨誘導(dǎo)時間延長，形態(tài)發(fā)生如前變化的細胞逐漸增多。誘導(dǎo)第14天左右部分細胞開始變圓，細胞邊界不清，核略呈偏位，核周顆粒密集，細胞逐漸聚集成團。 4、誘導(dǎo)后細胞Ⅱ型膠原免疫組化檢測：實驗組在TGF-β1向軟骨表型定向誘導(dǎo)后14d，Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示有部分細胞呈陽性，可見棕黃色顆粒分布于細胞胞漿內(nèi)而對照組