大鼠脂肪源性干細胞分離培養(yǎng)及與成纖維細胞間接共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著人口的老齡化，女性盆底功能障礙性疾?。≒elvic floor dysfunctional diseases PFD）的發(fā)病率逐年升高，是中老年婦女的常見疾病。女性盆底是由肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)構(gòu)成的支持系統(tǒng)。其互相作用和支持，承托并保持子宮、膀胱和直腸等盆腔臟器于正常位置。膠原蛋白則是韌帶和筋膜這些支持結(jié)構(gòu)的主要成分，對維持盆底支持組織的彈性和韌性起重要作用。研究表明，人體中有21種膠原蛋白分子。盆底

2、筋膜及韌帶主要是由I型膠原蛋白組成。I型膠原直徑較粗，有很高的抗張強度，起支持作用。隨著年齡的增長及其它相關(guān)病因的發(fā)生，人體內(nèi)筋膜和韌帶中成纖維細胞的增殖及表達I型膠原蛋白的能力逐漸降低，相關(guān)膠原含量的減少導(dǎo)致了韌帶、筋膜等解剖結(jié)構(gòu)張力降低，導(dǎo)致支持結(jié)構(gòu)的松弛，最終導(dǎo)致盆底功能障礙性疾病(PFD)的發(fā)生。
　　 應(yīng)用補片對盆底缺陷進行修復(fù)是目前治療盆底功能障礙性疾病(PFD)的重要方法，常用的補片包括人工合成材料和生物補片材料，

3、國內(nèi)、國外文獻報道人工合成補片具有侵蝕（erosion）并發(fā)癥，發(fā)生率約13％-26％不等，而生物補片雖然具有生物相容性好、侵蝕率低等優(yōu)點，但植入人體后的降解問題一直是臨床上爭論的焦點，其6個月后的降解率高達40％。因此，尋找新的替代材料，是減少盆底重建手術(shù)并發(fā)癥和降低術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。
　　 干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。干細胞的主要特征是能無限分裂增殖。2001年，Zuk等首次從人脂肪組織中分離獲得一群具有多向分化

4、潛能的細胞——即脂肪源性干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)。脂肪源性干細胞的主要優(yōu)點是：1、來源豐富，取材方便，對人體無創(chuàng)傷；2、干細胞豐度高，少量的脂肪組織即可獲得足夠脂肪源性干細胞（ADSCs）；3、較易培養(yǎng)，相較于其它種類的干細胞，脂肪源性干細胞（ADSCs）的培養(yǎng)要求相對較低；4、分裂增殖能力旺盛，脂肪源性干細胞（ADSCs）是目前生長最快的干細胞。因此脂肪源性干細胞（ADSCs）具有很好

5、的臨床運用前景。
　　 研究目的：
　　 1、探討ADSCs的分離培養(yǎng)的實驗方法，為干細胞實驗方法學(xué)提供依據(jù)。
　　 2、運用ADSCs與大鼠筋膜成纖維細胞間接共培養(yǎng)的方法，探討其對ADSCs表達I型膠原蛋白的影響。從而尋找能夠替代衰老或損傷的盆底成纖維細胞并有效表達膠原蛋白的種子細胞，為盆底功能障礙性疾病提供新的治療途徑。
　　 研究方法：
　　 1、用成年SD大鼠，雌雄不限，體重約為220-2

6、50g，取大鼠腹股溝側(cè)的脂肪組織，消化分離后進行傳代培養(yǎng)。取原代細胞分別以1×104/ml；1×106/ml；1×108/ml的細胞濃度接種,在1-7天后用MTT法檢測。用MTT法對1-13代細胞進行生長曲線的測定，并對第4代細胞行HE染色及細胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　 2、取第4代細胞進行表面標記物CD105、CD106、CD44、CD49d檢測，進行ADSCs鑒定。
　　 3、取經(jīng)鑒定的ADSCs和自體來源的大鼠筋膜成纖維

7、細胞間接共培養(yǎng)，在不同時間段取ADSCs用免疫細胞化學(xué)方法檢測其I型膠原蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、形成大量漩渦狀或長梭狀細胞集落，細胞表面標記物CD44，CD106，CD105，CD49d陽性率分別為99.59％，0.85％，95.00％，89.56％。
　　 2、MTT繪制生長曲線顯示大鼠脂肪源性干細胞經(jīng)多次傳代后細胞仍能保持較強的分裂增殖能力。體外培養(yǎng)第1、3、5、7代脂肪源性干細胞在1-2天處于

8、潛伏期及緩慢增長期，第3天進入對數(shù)生長期，第4天后進入平臺期，細胞生長曲線呈“S”形。第9-13代脂肪源性干細胞在第1-4天都處于潛伏期及緩慢增長期，第5-6天才進入對數(shù)生長期，第7天達到平臺期，細胞生長曲線呈“S”形。
　　 3、以1×104/ml原代細胞密度接種時，其生長曲線顯示：在體外培養(yǎng)1-3天處于潛伏期、第3-4天進入緩慢增長期，第4-6天為對數(shù)生長期，第7天后進入平臺期。以1×106/ml原代細胞密度接種時，其生長曲

9、線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長期，第3-5天進入對數(shù)生長期，第6天后進入平臺期。以1×108/ml原代細胞密度接種時，其生長曲線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長期，第3-4天進入對數(shù)生長期，第5天后進入平臺期。細胞生長曲線呈“S”形。
　　 4、HE染色觀察細胞形態(tài)顯示：第4代脂肪源性干細胞行HE染色后可見圓形細胞核呈紫色，核內(nèi)見粗顆粒狀染色質(zhì)，胞漿呈淡紅色。細胞呈長梭狀或多角狀。

10、
　　 5、與筋膜來源的成纖維細胞間接共培養(yǎng)3天、5天、7天的實驗組較對照組I型膠原蛋白含量顯著增加有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組中共培養(yǎng)5天、7天與3天比較I型膠原蛋白含量增加有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，實驗組中共培養(yǎng)7天與5天比較I型膠原蛋白含量增加無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實驗成功分離培養(yǎng)的大鼠脂肪源性干細胞，其表面標志物CD44，CD105，CD49d表達陽性，C

11、D106表達陰性，但仍需進一步進行干細胞誘導(dǎo)實驗加以證實。
　　 2、在一定范圍內(nèi)，不同的干細胞接種密度會影響脂肪源性干細胞的分裂增殖。本實驗證實以1×106/ml的ADSCs密度接種，細胞能較早進入對數(shù)生長期，且對數(shù)生長期持續(xù)時間最長。該細胞株持續(xù)至第13代仍然能夠保持旺盛的分裂增殖能力及形態(tài)特性。
　　 3、ADSCs與筋膜成纖維細胞間接共培養(yǎng)后，ADSCs表達I型膠原蛋白的含量增加。說明ADSCs與筋膜成纖維細胞間