大鼠脂肪源性干細(xì)胞分離培養(yǎng)及與成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著人口的老齡化，女性盆底功能障礙性疾病（Pelvic floor dysfunctional diseases PFD）的發(fā)病率逐年升高，是中老年婦女的常見疾病。女性盆底是由肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)構(gòu)成的支持系統(tǒng)。其互相作用和支持，承托并保持子宮、膀胱和直腸等盆腔臟器于正常位置。膠原蛋白則是韌帶和筋膜這些支持結(jié)構(gòu)的主要成分，對(duì)維持盆底支持組織的彈性和韌性起重要作用。研究表明，人體中有21種膠原蛋白分子。盆底

2、筋膜及韌帶主要是由I型膠原蛋白組成。I型膠原直徑較粗，有很高的抗張強(qiáng)度，起支持作用。隨著年齡的增長(zhǎng)及其它相關(guān)病因的發(fā)生，人體內(nèi)筋膜和韌帶中成纖維細(xì)胞的增殖及表達(dá)I型膠原蛋白的能力逐漸降低，相關(guān)膠原含量的減少導(dǎo)致了韌帶、筋膜等解剖結(jié)構(gòu)張力降低，導(dǎo)致支持結(jié)構(gòu)的松弛，最終導(dǎo)致盆底功能障礙性疾病(PFD)的發(fā)生。
　　 應(yīng)用補(bǔ)片對(duì)盆底缺陷進(jìn)行修復(fù)是目前治療盆底功能障礙性疾病(PFD)的重要方法，常用的補(bǔ)片包括人工合成材料和生物補(bǔ)片材料，

3、國(guó)內(nèi)、國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道人工合成補(bǔ)片具有侵蝕（erosion）并發(fā)癥，發(fā)生率約13％-26％不等，而生物補(bǔ)片雖然具有生物相容性好、侵蝕率低等優(yōu)點(diǎn)，但植入人體后的降解問題一直是臨床上爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，其6個(gè)月后的降解率高達(dá)40％。因此，尋找新的替代材料，是減少盆底重建手術(shù)并發(fā)癥和降低術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。
　　 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。干細(xì)胞的主要特征是能無(wú)限分裂增殖。2001年，Zuk等首次從人脂肪組織中分離獲得一群具有多向分化

4、潛能的細(xì)胞——即脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)。脂肪源性干細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是：1、來源豐富，取材方便，對(duì)人體無(wú)創(chuàng)傷；2、干細(xì)胞豐度高，少量的脂肪組織即可獲得足夠脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）；3、較易培養(yǎng)，相較于其它種類的干細(xì)胞，脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）的培養(yǎng)要求相對(duì)較低；4、分裂增殖能力旺盛，脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）是目前生長(zhǎng)最快的干細(xì)胞。因此脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）具有很好

5、的臨床運(yùn)用前景。
　　 研究目的：
　　 1、探討ADSCs的分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法，為干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法學(xué)提供依據(jù)。
　　 2、運(yùn)用ADSCs與大鼠筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的方法，探討其對(duì)ADSCs表達(dá)I型膠原蛋白的影響。從而尋找能夠替代衰老或損傷的盆底成纖維細(xì)胞并有效表達(dá)膠原蛋白的種子細(xì)胞，為盆底功能障礙性疾病提供新的治療途徑。
　　 研究方法：
　　 1、用成年SD大鼠，雌雄不限，體重約為220-2

6、50g，取大鼠腹股溝側(cè)的脂肪組織，消化分離后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取原代細(xì)胞分別以1×104/ml；1×106/ml；1×108/ml的細(xì)胞濃度接種,在1-7天后用MTT法檢測(cè)。用MTT法對(duì)1-13代細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，并對(duì)第4代細(xì)胞行HE染色及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　 2、取第4代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物CD105、CD106、CD44、CD49d檢測(cè)，進(jìn)行ADSCs鑒定。
　　 3、取經(jīng)鑒定的ADSCs和自體來源的大鼠筋膜成纖維

7、細(xì)胞間接共培養(yǎng)，在不同時(shí)間段取ADSCs用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)其I型膠原蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、形成大量漩渦狀或長(zhǎng)梭狀細(xì)胞集落，細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44，CD106，CD105，CD49d陽(yáng)性率分別為99.59％，0.85％，95.00％，89.56％。
　　 2、MTT繪制生長(zhǎng)曲線顯示大鼠脂肪源性干細(xì)胞經(jīng)多次傳代后細(xì)胞仍能保持較強(qiáng)的分裂增殖能力。體外培養(yǎng)第1、3、5、7代脂肪源性干細(xì)胞在1-2天處于

8、潛伏期及緩慢增長(zhǎng)期，第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形。第9-13代脂肪源性干細(xì)胞在第1-4天都處于潛伏期及緩慢增長(zhǎng)期，第5-6天才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形。
　　 3、以1×104/ml原代細(xì)胞密度接種時(shí)，其生長(zhǎng)曲線顯示：在體外培養(yǎng)1-3天處于潛伏期、第3-4天進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，第4-6天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天后進(jìn)入平臺(tái)期。以1×106/ml原代細(xì)胞密度接種時(shí)，其生長(zhǎng)曲

9、線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長(zhǎng)期，第3-5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天后進(jìn)入平臺(tái)期。以1×108/ml原代細(xì)胞密度接種時(shí)，其生長(zhǎng)曲線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長(zhǎng)期，第3-4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5天后進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形。
　　 4、HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)顯示：第4代脂肪源性干細(xì)胞行HE染色后可見圓形細(xì)胞核呈紫色，核內(nèi)見粗顆粒狀染色質(zhì)，胞漿呈淡紅色。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀或多角狀。

10、
　　 5、與筋膜來源的成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)3天、5天、7天的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組I型膠原蛋白含量顯著增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中共培養(yǎng)5天、7天與3天比較I型膠原蛋白含量增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組中共培養(yǎng)7天與5天比較I型膠原蛋白含量增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)的大鼠脂肪源性干細(xì)胞，其表面標(biāo)志物CD44，CD105，CD49d表達(dá)陽(yáng)性，C

11、D106表達(dá)陰性，但仍需進(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。
　　 2、在一定范圍內(nèi)，不同的干細(xì)胞接種密度會(huì)影響脂肪源性干細(xì)胞的分裂增殖。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)以1×106/ml的ADSCs密度接種，細(xì)胞能較早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。該細(xì)胞株持續(xù)至第13代仍然能夠保持旺盛的分裂增殖能力及形態(tài)特性。
　　 3、ADSCs與筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)后，ADSCs表達(dá)I型膠原蛋白的含量增加。說明ADSCs與筋膜成纖維細(xì)胞間