大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與肌腱細(xì)胞在體外間接共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肌腱病的治療是臨床骨科的難點(diǎn)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用為肌腱病的治療提供了新思路。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能并可以被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，但由于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)制及在治療過程中的作用方式尚未明確，限制了其在肌腱病治療中的應(yīng)用。本課題通過體外構(gòu)建骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與自體肌腱細(xì)胞的間接共培養(yǎng)體系，在單純間接共培養(yǎng)環(huán)境下與間接共培養(yǎng)同時(shí)添加自體富血小板血漿進(jìn)行干預(yù)的情況下研究間接共培養(yǎng)環(huán)境對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用，以探索骨髓基質(zhì)干

2、細(xì)胞的分化機(jī)制并為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在肌腱病治療中的應(yīng)用提供參考。
　　 方法：應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞。體外采集大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并擴(kuò)增。采集大鼠血液制備富血小板血漿并激活以獲取富血小板血漿萃取液。利用孔徑0.4μm的細(xì)胞共培養(yǎng)嵌盒與6孔板構(gòu)建培養(yǎng)液相通但細(xì)胞不直接接觸的間接共培養(yǎng)體系。將生長狀態(tài)良好的第三代(P3)大鼠肌腱細(xì)胞及第四代大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(P4)用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞被接種于間接共培養(yǎng)體系外室，

3、將同體肌腱細(xì)胞種植于內(nèi)室，另外單獨(dú)設(shè)置一組間接共培養(yǎng)組并加入富血小板血漿萃取液。于間接共培養(yǎng)后第3天、第7天及第10天，分別提取各組間接共培養(yǎng)體系內(nèi)外室的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并利用RT-PCR及免疫組化染色技術(shù)分別對(duì)各組肌腱細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的Ⅰ型膠原與腱調(diào)蛋白(TNMD)進(jìn)行基因?qū)用媾c蛋白層面的檢測(cè)，以分析間接共培養(yǎng)環(huán)境對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化與細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法成功分離出細(xì)胞，并經(jīng)鑒定證實(shí)為肌

4、腱細(xì)胞。應(yīng)用肌腱細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞間接共培養(yǎng)3天后，間接共培養(yǎng)組的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在RT-PCR檢測(cè)與免疫組化染色檢測(cè)中均未表達(dá)Ⅰ型膠原與腱調(diào)蛋白(TNMD)。間接共培養(yǎng)7天后，間接共培養(yǎng)組干細(xì)胞在Ⅰ型膠原的PCR電泳圖像中出現(xiàn)模糊條帶，同時(shí)Ⅰ型膠原免疫組化顯示部分細(xì)胞呈弱陽性染色，單純間接共培養(yǎng)組與富血小板血漿干預(yù)組之間結(jié)果無顯著差異。間接共培養(yǎng)組干細(xì)胞在各種檢測(cè)中未出現(xiàn)對(duì)腱調(diào)蛋白(TNMD)的表達(dá)。間接共培養(yǎng)10天后，間接共培養(yǎng)組干

5、細(xì)胞在Ⅰ型膠原的PCR電泳圖像中出現(xiàn)清晰條帶，但亮度低于肌腱細(xì)胞對(duì)照組。同時(shí)Ⅰ型膠原免疫組化顯示間接共培養(yǎng)組干細(xì)胞呈廣泛弱陽性染色，通過測(cè)定免疫組化結(jié)果的平均光密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示間接共培養(yǎng)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)量顯著高于干細(xì)胞陰性對(duì)照組，但低于肌腱細(xì)胞對(duì)照組。間接共培養(yǎng)組干細(xì)胞在腱調(diào)蛋白(TNMD)的PCR電泳圖像中表現(xiàn)為模糊條帶，但腱調(diào)蛋白(TNMD)免疫組化染色結(jié)果為陰性。
　　 結(jié)論：通過組織塊培養(yǎng)法可以在