與心肌細(xì)胞體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)是一種骨髓來源的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。它在一定條件下可以向多種結(jié)締組織及部分來源于外胚層的組織分化，能形成骨、軟骨、骨骼肌、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。缺血性心臟病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，可導(dǎo)致心肌梗塞，最終誘發(fā)心力衰竭?，F(xiàn)有的治療方法只能部分改善心肌的缺血情況，防止進(jìn)一步的心肌損害，并不能修復(fù)受損心肌，使已有心肌病變逆轉(zhuǎn)，所以移植成肌細(xì)胞進(jìn)入心肌組織形成新的心肌修復(fù)受損心肌受到廣泛關(guān)注。隨著

2、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞移植治療心肌梗死和心力衰竭成為可能。由于自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞無移植后免疫排斥反應(yīng)，且細(xì)胞在體外有良好增殖能力，并能在適宜條件誘導(dǎo)下分化為損傷組織所需要的細(xì)胞，因而在心肌損傷的治療中備受重視。研究表明5-氮胞苷(5-aza)可以作為體外的化學(xué)誘導(dǎo)劑使BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化，但是有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-aza作為一種化學(xué)物質(zhì)，在誘導(dǎo)分化的同時(shí)對(duì)細(xì)胞也具有一定毒性作用。同時(shí)心肌樣微環(huán)境作為能使BMSCs向心肌細(xì)胞定向分

3、化的另一因素越來越受到重視。有人提出體內(nèi)微環(huán)境中有許多因素參與干細(xì)胞的分化，主要有化學(xué)因素和物理因素，前者是指細(xì)胞因子等，后者主要是指細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，如縫隙連接、電刺激、收縮等。實(shí)驗(yàn)證明BMSCs無論異體移植、自體移植對(duì)心肌梗死后心功能的改善均有一定的作用。本實(shí)驗(yàn)采用BMSCs與心肌細(xì)胞體外共培養(yǎng)模擬心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs分化，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、激光共聚焦顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察等方法，探討B(tài)MSCs誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞與心

4、肌樣微環(huán)境的關(guān)系。 方法： 1.骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)取出生2-3周的SD大鼠乳鼠，用水合氯醛麻醉、75％酒精消毒后，取股骨、脛骨骨髓，采用貼壁細(xì)胞分離法分離BMSCs，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。 2.心肌細(xì)胞培養(yǎng)取出生1-5天的SD大鼠乳鼠，75％酒精消毒，開胸取心室肌剪成1mm3小塊，用胰蛋白酶和膠原酶消化后，將細(xì)胞以105/ml接種于培養(yǎng)瓶中放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3.骨髓基

5、質(zhì)細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)將第三代的BMSCs從培養(yǎng)瓶消化解離，以103/ml的密度加入心肌細(xì)胞中，搖勻后進(jìn)行共培養(yǎng)。取其中一部分BMSCs，于共培養(yǎng)前24小時(shí)先用DAPI標(biāo)記2小時(shí)，用于進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的第4天、第8天、第16天分別取出細(xì)胞爬片各為一組，單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs作為對(duì)照組，用4％多聚甲醛固定后每組分別進(jìn)行α-Actin、TnT抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 5.激光掃

6、描共聚焦顯微鏡觀察三組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中首先加CD44作為第一個(gè)一抗，過夜，每組再分別加入α-Actin、TnT作為第二個(gè)一抗，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察抗體表達(dá)。 6.熒光顯微鏡觀察將用DAPI標(biāo)記過的BMSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的第4天、第8天、第16天分別取出細(xì)胞爬片，各為一組，單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs作為對(duì)照組，用4％多聚甲醛固定后，每組分別進(jìn)行α-Actin、TnT抗體檢測(cè)。用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)

7、論： 1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色共培養(yǎng)第4天、第8天、第16天三組細(xì)胞中α-Actin、TnT均有表達(dá)，對(duì)照組α-Actin與TnT均陰性表達(dá)，說明共培養(yǎng)可誘導(dǎo)BMSCs分化表達(dá)心肌特異性抗體。其中共培養(yǎng)第8天BMSCs陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量最多，α-Actin與TnT陽性表達(dá)率最強(qiáng)，至共培養(yǎng)第16天，α-Actin與TnT陽性表達(dá)率比共培養(yǎng)第8天有所下降。 2.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CD44是BMSCs一種表面分子，細(xì)胞CD4