脂肪干細胞修復(fù)成纖維細胞放射性損傷的機制研究.pdf

1、核泄漏事件、日常放療造成的醫(yī)源性放射損傷和制造業(yè)的輻射消毒等使人類暴露在放射性射線的危險性大大提高。放射性皮膚損傷是放射治療中最常見的并發(fā)癥，是指放療過程中各種放射性元素對放療區(qū)域皮膚組織造成的肉眼可見的病損，常見的放射性元素包括X線、γ射線、質(zhì)子、粒子以及電子等各類電離輻射。放射性皮膚損傷的發(fā)生率很高，若不采取保護措施，約90％的放療患者會出現(xiàn)局部皮膚紅斑，嚴(yán)重者會發(fā)生皮膚脫落和潰瘍，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。真皮和結(jié)締組織中主要細胞組成

2、為成纖維細胞(Fibroblasts，F(xiàn)b)，它在創(chuàng)面修復(fù)過程發(fā)揮主導(dǎo)作用。
　　脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是脂肪來源的具有多種分化潛能的干細胞。它取材方便、能向多種細胞分化并且能分泌多種細胞因子來修復(fù)損傷。ADSCs與放射損傷的修復(fù)關(guān)系密切，可能通過自分泌和誘導(dǎo)效應(yīng)細胞旁分泌多種細胞因子修復(fù)放射損傷。何種細胞因子通過何種途徑參與這種修復(fù)過程尚未明確。
　　磷脂酰肌醇3激酶

3、-蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase-protein kinase B，PI3K-PKB，也稱PI3K-Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(rnitogen-activated protein kinase，MAPK)通路在放射損傷中的調(diào)控作用在多項研究中得到證實，近年來已明確部分長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在放射領(lǐng)域扮演重要角色，部分LncRNA與PI3K-Akt通

4、路發(fā)生相互作用也受到關(guān)注。ADSCs在放射損傷修復(fù)中通過何種信號通路發(fā)揮作用，LncRNA是否參與其修復(fù)機制目前尚未明確。
　　基于以上考慮，本課題擬通過高通量測序和基因沉默技術(shù)對ADSCs修復(fù)放射性損傷機制進行研究。
　　第一部分 ADSCs和Fb原代培養(yǎng)、共培養(yǎng)模型的建立以及ADSCs對Fb放射損傷后的影響
　　目的:原代提取ADSCs和Fb，建立共培養(yǎng)模型研究ADSCs的干預(yù)對放射損傷成纖維細胞增殖、凋亡以及細胞

5、周期的影響。
　　方法:用酶消化法從大鼠腹股溝脂肪和真皮組織中原代提取ADSCs和Fb，通過流式細胞技術(shù)、多向誘導(dǎo)分化以及免疫細胞化學(xué)進行鑒定。用0.4μmTranswell共培養(yǎng)板建立非接觸式共培養(yǎng)模型，建模成功后實驗分為4組，F(xiàn)b1組為成纖維細胞對照組，F(xiàn)b2組為8GyX射線照射的成纖維細胞組，F(xiàn)b3組為ADSCs干預(yù)的8GyX射線照射的成纖維細胞組，陰性對照組為NRK細胞干預(yù)的8GyX射線照射的成纖維細胞組。CCK-8法檢測

6、細胞增殖，流式細胞儀檢測凋亡和周期變化。
　　結(jié)果:酶消化法能提取較高純度原代細胞，經(jīng)鑒定提取的ADSCs可向成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化，ADSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD31和CD45陽性率達標(biāo)，成纖維細胞高表達波形蛋白Vimentin。Fb2組經(jīng)8Gy放射損傷的成纖維細胞較Fb1對照組增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)b3組ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的成纖維細胞增殖能力較Fb2組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

7、P＜0.05)。Fb2組較Fb1對照組凋亡顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)b3組ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的成纖維細胞凋亡較Fb2組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。8Gy照射后Fb2組成纖維細胞周期阻滯在G2期，ADSCs干預(yù)后Fb3組細胞周期較Fb2組由G2/M向G1/S進展，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成纖維細胞在接受了8GyX射線放照射后細胞增殖活力減弱、凋亡增加、周期阻滯在G2期。當(dāng)

8、我們進行了ADSCs的共培養(yǎng)干預(yù)后成纖維細胞增殖活力增強、凋亡減少、細胞周期進程加快。
　　第二部分 ADSCs對大鼠放射性皮膚損傷的影響
　　目的:研究ADSCs在大鼠放射性皮膚損傷模型體內(nèi)的存活情況以及對大鼠放射性皮膚損傷導(dǎo)致的凋亡的影響。
　　方法:改良Rifkin LH皮膚放射模型，實驗分為5組，空白對照組、單純照射組、ADSCs靜脈注射組、ADSCs局部注射組和PBS局部注射組。照射采用背部2cm×2cm區(qū)域

9、接受20Gy照射，ADSCs注射量為2×106，Luciferase和GFP雙標(biāo)慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記。不同時間點用小動物活體成像系統(tǒng)觀察ADSCs在體內(nèi)存活情況，取材進行冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察，制作石蠟切片行Tunnel凋亡染色。
　　結(jié)果:ADSCs靜脈注射組出現(xiàn)肺攔截，24h左右活體成像顯示熒光消失，ADSCs局部注射組至少在注射后15天內(nèi)仍然能夠檢測到熒光。單純照射組較空白對照組凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

10、ADSCs局部注射組較單純照射組凋亡顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ADSCs靜脈注射組較單純照射組凋亡降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:2×106 ADSCs局部注射在經(jīng)20Gy照射的大鼠背部皮膚可以至少存活15天，ADSCs可以使放射性皮膚損傷引起的凋亡降低。
　　第三部分 ADSCs對Fb放射性損傷干預(yù)的高通量mRNA/LncRNA測序、蛋白質(zhì)譜檢測以及驗證
　　目的:ADSCs共培

11、養(yǎng)干預(yù)放射損傷的成纖維細胞，篩查基因和蛋白水平的差異表達，預(yù)測可能發(fā)揮作用的信號通路并進行驗證。
　　方法:實驗分為空白對照Fb組、8Gy照射后的Fb2組以及經(jīng)ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)后的Fb3組。采用高通量mRNA/LncRNA測序和蛋白質(zhì)譜檢測篩選出差異基因和蛋白，測序和蛋白質(zhì)譜聯(lián)合分析可能作用的信號通路，篩查LncRNA并預(yù)測靶基因。
　　結(jié)果:8Gy照射后的Fb2組較空白對照組P53通路發(fā)生明顯上調(diào)。經(jīng)ADSCs共培養(yǎng)干

12、預(yù)后的Fb3組較單純8Gy照射的Fb2組PI3K-Akt和MAPK通路顯著上調(diào)。Real time-PCR和Western-blot驗證與以上通路相關(guān)的凋亡和周期分子，F(xiàn)b2 vs Fb1上調(diào)的有P53、P21、P27、CyclinB、Bax以及Cleaved Caspase-3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);下調(diào)的有Cyclin D1、Bcl-2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Fb3 vsFb2上調(diào)的有Cyclin D1、Bc

13、l-2和c-myc，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);下調(diào)的有CyclinB、Bax、Cleaved Caspase-3、P21和P27，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。從篩查出的40條LncRNA結(jié)合Real time-PCR驗證，鎖定變化最顯著的4條，分別是LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034和LNC_001030。
　　結(jié)論:8GyX線照射后的成纖維細胞可能通過P53通路上調(diào)介導(dǎo)

14、放射損傷，ADSCs可能通過PI3K-Akt和MAPK通路激活使成纖維細胞發(fā)生修復(fù)。LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034和LNC_001030可能在ADSCs修復(fù)成纖維細胞放射損傷中扮演重要角色。
　　第四部分 ADSCs修復(fù)成纖維細胞放射性損傷的機制研究
　　目的:檢測共培養(yǎng)上清液中差異表達的細胞因子，用篩查出的細胞因子干預(yù)放射損傷成纖維細胞后研究其增殖、凋亡和細胞周期的變化以及

15、在信號通路中的作用。初步探討LncRNA_473在ADSCs修復(fù)成纖維細胞放射損傷中的作用。
　　方法:細胞因子蛋白芯片篩查共培養(yǎng)上清中的差異表達并進行Elisa驗證。用篩查出的細胞因子刺激放射損傷的成纖維細胞，檢測其增殖、凋亡及周期的變化，Western-blot檢測相關(guān)通路的激活情況。成纖維細胞轉(zhuǎn)染shRNA沉默LncRNA_473，檢測ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)下成纖維細胞增殖和凋亡情況。
　　結(jié)果:細胞因子GM-CSF組和

16、VEGF組較對照組p-Akt和p-Erk表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這說明GM-CSF組和VEGF可能通過激活PI3K-Akt和MAPK通路發(fā)揮放射損傷修復(fù)作用。ADSCs共培養(yǎng)同時沉默LncRNA_473，成纖維細胞增殖能力較單純ADSCs共培養(yǎng)組成纖維細胞增殖能力下降、凋亡增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:GM-CSF、VEGF和LncRNA_473可能在ADSCs修復(fù)成纖維細胞放射損傷中發(fā)揮