mTOR通路調(diào)控早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞在氧化細(xì)胞損傷和修復(fù)中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：研究不同濃度及時(shí)間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖和凋亡情況；進(jìn)一步探究雷帕霉素干預(yù)后不同濃度及時(shí)間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖和凋亡情況；研究小RNA干擾后早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖和凋亡情況，同時(shí)分析其對(duì)mTOR通路上下游主要分子的基因和蛋白表達(dá)情況；進(jìn)一步探究高體積分?jǐn)?shù)氧、雷帕霉素及小RNA干擾對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)各膠原、凋亡相關(guān)基因和促纖維化因子的蛋白表達(dá)影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)對(duì)象為早產(chǎn)小鼠肺成纖維細(xì)胞即L929細(xì)胞。將新鮮完全

2、培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞于21％，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，MTT法評(píng)估細(xì)胞增殖；將含有10nM雷帕霉素的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞于21%，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，MTT法評(píng)估細(xì)胞增殖；通過(guò)小RNA干擾將細(xì)

3、胞分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，應(yīng)用MTT法評(píng)估兩組細(xì)胞的增殖情況，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡情況，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)mTOR通路上下游主要分子mTOR、4EBP1、P70S6K的蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)mTOR通路上下游主要分子mTORC1、4EBP1、P70S6K的基因水平，了解早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞在氧化性細(xì)胞損傷和修復(fù)中的作用及mTOR信號(hào)通路機(jī)制；將細(xì)胞分為90%氧濃度組、轉(zhuǎn)

4、染組、90%氧濃度+雷帕霉素組和對(duì)照組，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的水平，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2和P53的蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)促纖維化因子CTGF和TGF-β的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.高濃度氧干預(yù)的結(jié)果
　　a.高氧暴露后L929細(xì)胞增殖活性減弱，且隨著氧濃度和氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)L929細(xì)胞增殖活性減弱越明顯，與空氣對(duì)

5、照組比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高氧暴露后抑制細(xì)胞增殖，抑制率隨氧濃度和暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　　b.高氧暴露后加速L929細(xì)胞凋亡壞死，隨著氧濃度和氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)L929細(xì)胞凋亡率增加，與空氣對(duì)照組比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　c.高氧暴露后細(xì)胞胞體折光率降低，胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻，狀態(tài)欠佳，細(xì)胞數(shù)量隨氧濃度和氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。
　　2.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后的結(jié)果

6、　　a.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后L929細(xì)胞增殖活性明顯減弱，且隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時(shí)間的延長(zhǎng)L929細(xì)胞增殖活性減弱越明顯，與空氣+雷帕霉素組比較具顯著性差異(P<0.01)；60%的高氧暴露后增殖抑制更明顯；雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后可抑制細(xì)胞增殖，其抑制率隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
　　b.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后加速L929細(xì)胞凋亡壞死，隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時(shí)間的延長(zhǎng) L929細(xì)

7、胞凋亡率增加，與空氣對(duì)照組比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　c.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后細(xì)胞胞體折光率降低，胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻，狀態(tài)欠佳，細(xì)胞數(shù)量隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。
　　3.mTORsiRNA干擾對(duì)L929細(xì)胞增殖、凋亡及mTOR信號(hào)通路上下游分子的蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果
　　a.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的蛋白表達(dá)下降，與非

8、轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　b.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的mRNA表達(dá)下降，與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　c.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組L929細(xì)胞增殖活性減弱，與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)；mTORsiRNA干擾后抑制L929細(xì)胞增殖，其抑制率為26.71%。
　　d.mTORsiRNA干擾后可加速L929細(xì)胞凋亡，與

9、與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　4.高濃度氧、雷帕霉素及mTORsiRNA干預(yù)對(duì)L929細(xì)胞外基質(zhì)影響的結(jié)果
　　a.與空氣對(duì)照相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空氣對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組的col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　b.與空氣對(duì)照相比，90%高氧組、

10、90%高氧+雷帕霉素組、轉(zhuǎn)染組肺成纖維細(xì)胞的bcl-2蛋白表達(dá)減少，P53蛋白表達(dá)增加，差異有顯著性(P<0.01)。
　　c.與空氣對(duì)照組相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組的CTGF和TGF-β蛋白表達(dá)均升高，轉(zhuǎn)染組的CTGF和TGF-β蛋白表達(dá)均下降，差異有顯著性(P<0.01)；
　　結(jié)論：
　　1.單純高濃度氧作用于體外培養(yǎng)的早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞時(shí)， 可抑制其增殖，加速凋亡。
　　2.雷帕霉

11、素可抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖，加速凋亡，其可能的機(jī)制是通過(guò)mTOR信號(hào)通路。
　　3.mTORsiRNA可抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖，加速凋亡。
　　4.雷帕霉素、mTORsiRNA抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的可能機(jī)制是通過(guò)mTOR信號(hào)通路，特異性地抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞中mTORC1、4EBP1和P70S6K蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　5.90%濃度高氧、雷帕霉素均可促進(jìn)高氧暴露后早產(chǎn)小鼠肺成纖維細(xì)胞的col-Ⅰ、

12、col-Ⅲ和FN增多，阻斷其增多的可能機(jī)制是通過(guò)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　6.Bcl-2是抗凋亡因子，可抑制肺成纖維細(xì)胞凋亡；P53是促凋亡因子，可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞凋亡。90%濃度高氧、雷帕霉素、mTORsiRNA轉(zhuǎn)染均可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞凋亡。
　　7.CTGF和TGF-β在氧化細(xì)胞損傷BPD肺纖維化時(shí)促纖維化作用的可能機(jī)制是通過(guò)mTOR信號(hào)通路，即mTOR信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)CTGF和TGF-β的表達(dá)促進(jìn)早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞