miR146a在肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)小鼠肺纖維化造模，體外培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞，TGF-β1（transforming growth factor-β1）刺激肺成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后，蛋白質(zhì)印跡法（Western-blotting，WB）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)在不同轉(zhuǎn)化程度中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF rece

2、ptor associated factor6，TRAF6）蛋白、microRNA-146a（miR146a）的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，以探討miR146a在肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、將40只小鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、博來(lái)霉素肺纖維化組（模型組）；對(duì)照組予以氣管內(nèi)灌注生理鹽水，模型組則氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素溶液（2.5mg/kg），于造模后第4周處死小鼠。
　　2、采用肺組織蘇木精一伊紅染色法（hem

3、atoxylin-eosin staining,HE染色）的方法來(lái)驗(yàn)證纖維化模型是否構(gòu)建成功；
　　3、肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定，用細(xì)胞貼壁法結(jié)合胰酶法獲得肺成纖維細(xì)胞，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，并拍照記錄以及免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色測(cè)定成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記物兩種方法鑒定肺成纖維細(xì)胞；
　　4、將細(xì)胞分成四個(gè)組，標(biāo)記為A（空白對(duì)照組）、B、C、D組，分別用濃度為0、5、10、15ug/l的TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞發(fā)

4、生表型轉(zhuǎn)化，用WB檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）TRAF6蛋白的表達(dá)，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR146a的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化小鼠模型，成功培養(yǎng)出肺成纖維細(xì)胞，并用TGF-β1進(jìn)行誘導(dǎo)24小時(shí)。
　　1、隨著TGF-β1濃度的提高，α-SMA蛋白、TRAF6蛋白的表達(dá)均呈濃度依賴性增高，四組細(xì)胞的α-SMA蛋白、TRAF

5、6蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：（（TRAF6）F=41.25；（a-SMA）F=150.04，P＜0.01， P＜0.05）；
　　2、四組間miR146a基因的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=335.00，P＜0.01， P＜0.05），無(wú)TGF-β1刺激時(shí)，miR146a呈低表達(dá)，B組TGF-β1濃度為5ug/l刺激下的表達(dá)最高，然后呈濃度依賴性下降趨勢(shì)；
　　3、在TGF-β1誘導(dǎo)下的肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化率越高（α-SMA表達(dá)越高），