尾加壓素Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在促進(jìn)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的相互作用.pdf

1、目的：血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?cè)谘苤厮?、纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本室前期研究發(fā)現(xiàn)，尾加壓素II（UII）能夠促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變、促進(jìn)膠原合成，其機(jī)制尚待闡明。已知轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1 ）是促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和膠原合成的重要活性因子，為此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞，觀察尾加壓素II刺激后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 表達(dá)的變化，以及UII 、TGF-β1處理后α-平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA及蛋

2、白表達(dá)的變化，探討UII對(duì)TGF-β1 表達(dá)的影響以及兩者在促血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的相互作用及其機(jī)制。
　　 方法：①用貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管外膜成纖維細(xì)胞，取3～5 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，以1×10-10～1×10-7mol/L 尾加壓素II刺激血管外膜成纖維細(xì)胞24h ，或以1×10-8 mol/L尾加壓素II 刺激血管外膜成纖維細(xì)胞8h 、12h 、24h 、48h ，或以1×10-7 mol/L尾加壓素II受體阻斷

3、劑SB-710411分別作用24h 、48h ，提取上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）測(cè)各組上清液中TGF-β1 蛋白含量；②將細(xì)胞分為單純培養(yǎng)基對(duì)照組、UII （10 -8 mol/L ）組、TGF-β1 （20ng/mL ）組、UII （10 -8 mol/L ）+TGF-β1 （20ng/mL ）、UII （10 -8 mol/L ）+ TGF-β1特異性中和抗體（20ug/ml ）組以及TGF-β1 （20ng/mL ）+

4、SB-710411 （10 -7 mol/L ）組，培養(yǎng)24h后，用蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blotting ）及實(shí)時(shí)定量PCR （Real-time PCR ）方法分別檢測(cè)α -平滑肌肌動(dòng)蛋白及mRNA 表達(dá)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s ）表示，兩組間均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴UII以時(shí)間依賴(lài)方式促進(jìn)Afs 分泌TGF-β1 ，用U

5、II（10 -8 mol/L ）分別刺激成纖維細(xì)胞8 、12 、24 、48h 后，TGF-β1分泌量隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，在24h 達(dá)峰，48h 呈下降趨勢(shì)，各組與對(duì)照組相比，分別增高13.86％（P<0.05 ）、36.41％（P<0.01 ）、69.82％（P<0.01 ）、30.02％（P<0.01 ），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵UII以濃度依賴(lài)方式促進(jìn)Afs 分泌TGF-β1 ，10 -10 mol/L 、10 -9 mol/

6、L 、10 -8 mol/L UII 刺激組分別較對(duì)照組高29.50％、41.99％、59.92％（均為P<0.01 ）、10 -7 mol/L UII 組雖略低于10 -8 UII刺激組，但仍較對(duì)照組高47.79％（P<0.01 ）。⑶UII 的促TGF-β1 分泌作用能被UII 受體阻斷劑SB-710411 所阻斷，24h 、48h 分別較UII 刺激組下降44.20％、33.33％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。⑶UII

7、、TGF-β1均有促進(jìn)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，α -SM–actin mRNA表達(dá)分別較空白對(duì)照組增加160.83％（P<0.01 ）、225.80％（P<0.01 ）；α -SM–actin蛋白表達(dá)分別較對(duì)照組增加18.75％（P<0.01 ）、20.87％（P<0.01 ）；⑷UII受體阻斷劑SB-710411 及TGF-β1 特異性中和抗體能抑制TGF-β1 、UII 的促α -SM–actin 表達(dá)作用，α -SM

8、–actin mRNA 表達(dá)分別較UII 及TGF-β1 組下降59.59％（P<0.01 ）、61.86％（P<0.01 ），α -SM–actin 蛋白表達(dá)分別較UII 及TGF-β1 組下降17.83％（P<0.01 ）、17.15％（P<0.01 ）；⑸UII 和TGF-β1 共同刺激組較單獨(dú)刺激組而言，α -SM–actin mRNA 表達(dá)與UII 組相比增加38.83％ (P<0.05)，與TGF-β1組比較增加11.14％