阿托伐他汀對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-,1-誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：本試驗(yàn)應(yīng)用阿托伐他汀來(lái)干預(yù)肺纖維化模型大鼠的肺成纖維細(xì)胞以及由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，觀察該藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad-3mRNA含量的影響，從而了解阿托伐他汀抗大鼠肺纖維化作用，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。 方法：選用雌性Wistar大鼠(體重1

2、50-170g)分為兩組，每組兩只，試驗(yàn)組大鼠給予一次性氣管內(nèi)注入博萊霉素溶液(5mg/Kg體重)建立肺纖維化模型，對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水。手術(shù)后在原條件下繼續(xù)飼養(yǎng)一周后無(wú)菌條件下取鼠肺，應(yīng)用消化法于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)，自然法純化，傳代至第四代始，以成纖維細(xì)胞內(nèi)波形蛋白為目標(biāo)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，同時(shí)應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法來(lái)鑒定細(xì)胞。選取0、0.1、1、5、10μM五個(gè)濃度劑量的阿托伐他汀分別對(duì)試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)

3、，應(yīng)用MTT法連續(xù)七天測(cè)定細(xì)胞增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線；對(duì)照組、試驗(yàn)組細(xì)胞又分別分出無(wú)干預(yù)因素組、TGF-β1單獨(dú)干預(yù)組、TGF-β1聯(lián)合不同濃度藥物干預(yù)組，仍然應(yīng)用MTT法觀察藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況；SP法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察藥物對(duì)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)的影響；熒光定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad3mRNA含量的影響。結(jié)果： 1大鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化經(jīng)純化傳代后，成纖維細(xì)胞形

4、態(tài)單一，胞體較大，均大致呈梭形，均有細(xì)長(zhǎng)纖維絲。胞漿清晰。與博萊霉素試驗(yàn)組細(xì)胞相比，生理鹽水對(duì)照組細(xì)胞胞體略小，開始時(shí)生長(zhǎng)較緩慢，隨著代數(shù)增高生長(zhǎng)逐漸變快。而博萊霉素組細(xì)胞胞體較大，形狀也不如鹽水組細(xì)胞規(guī)則，有一些胞突，核漿比例高，生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組。 2成纖維細(xì)胞的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：所培養(yǎng)細(xì)胞在光鏡下呈典型的梭形，胞體狹長(zhǎng)、透亮，胞漿豐富，胞膜清晰。經(jīng)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)鑒定，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組成纖維

5、細(xì)胞均可達(dá)95％以上。 3阿托伐他汀對(duì)纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料方差分析可知，各劑量組中不同干預(yù)天數(shù)所測(cè)得的OD值之間存在顯著差異(P＜0.01)。各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)0D值與不同用藥物劑量之間存在交互作用(P＜0.01)。各劑量組對(duì)細(xì)胞的抑制作用之間存在顯著差別(P＜0.01)。 4阿托伐他汀對(duì)TGF-B1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞增殖的影響無(wú)論是博萊霉素實(shí)驗(yàn)組還是生理鹽水對(duì)照組的藥物因素對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖均

6、有影響(P＜0.01)，事后兩兩比較顯示兩組細(xì)胞中除無(wú)干預(yù)因素組與1μM藥物組、FGF-β1單獨(dú)誘導(dǎo)組與0.1μM藥物組OD值之間無(wú)差異(P＞0.05)之外，其余各組兩兩互比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。區(qū)組因素對(duì)細(xì)胞OD值有影響，實(shí)驗(yàn)組OD值較對(duì)照組要高(P＜0.01)。 5阿托伐他汀對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性產(chǎn)物α-SMA表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示無(wú)論對(duì)于實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，藥物因素對(duì)α-SMA的表達(dá)量

7、(灰度值)都有影響(P＜0.01)。各劑量組之間α-SMA的表達(dá)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。區(qū)組因素對(duì)α-SMA的表達(dá)量有影響，實(shí)驗(yàn)組α-SMA的表達(dá)量較對(duì)照組要高(P＜0.01)。 6阿托伐他汀對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺肌成纖維細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad3mRNA表達(dá)量的影響實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：無(wú)論是博萊霉素實(shí)驗(yàn)組還是生理鹽水對(duì)照組的藥物因素對(duì)Smad3mRNA表達(dá)量均有影響(P＜0.01)，事后兩兩比較顯示

8、：無(wú)干預(yù)因素組與5μM藥物組、0.1μM與TGF-β1單獨(dú)組、1μM與0.1μM藥物組Smad3mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞Smad3mRNA表達(dá)量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：1肺纖維化大鼠肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞與正常肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞相比具有表型輕度分化和增殖速度快的特點(diǎn)。2阿托伐他汀能夠抑制肺纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖。3該藥同時(shí)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分