尾加壓素II刺激大鼠主動脈外膜成纖維細(xì)胞表達白細(xì)胞介素-6的作用及機制研究.pdf

1、背景:尾加壓素II(urotensin II,UII)是一種生長抑制素樣神經(jīng)環(huán)肽,是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管活性肽,主要作用有收縮血管、促進血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、促進膠原合成、細(xì)胞遷移和促進泡沫細(xì)胞形成等作用,亦有報道 UII能夠促進血管增生。此外,有報道心力衰竭患者或心肌肥大、血管再狹窄動物模型血漿和心血管組織 UII升高,表明UII參與了多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn),UII能夠促進大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表達骨

2、橋蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1),提示 UII可能參與了血管的炎癥反應(yīng),而炎癥機制是目前動脈硬化性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一,其中外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblasts Afs)又在血管的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。作為炎癥反應(yīng)中最重要的炎癥因子之一的白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不可替代的作用。

3、因此闡明尾加壓素 II和IL-6在血管的炎癥反應(yīng)中的相互作用,對于揭示血管炎癥和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生機制具有重要的意義。
　　目的:觀察UII對血管外膜成纖維細(xì)胞表達IL-6的作用,并進一步探討其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　方法:取雄性SD大鼠(體重150～180g),分離胸主動脈外膜,采用組織貼塊法培養(yǎng)外膜成纖維細(xì)胞,實驗用3-5代細(xì)胞。實驗分組:(1)對照組:細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified

4、 Eagle Medium, DMEM)中培養(yǎng);(2)UII刺激組:按照實驗設(shè)計,分為不同濃度UII刺激組(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)和不同時間刺激組,后者將細(xì)胞和 UII(10-8mol/L)共孵育不同時間(1h,3h,6h,12h,24h);(3)UII+細(xì)胞內(nèi)不同信號通路抑制劑組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入不同信號通路抑制劑,如 UII受體阻斷劑SB710411(10-6mol/L)、鈣通道阻斷劑nicardipi

5、ne(10-5mol/L)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢霉素A(Cyclosporine A,CSA,10-5mol/L)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抑制劑PD98059(10-5mol/L)、蛋白激酶C(protien kinase C, PKC)抑制劑H7(10-5 mol/L)和Rho激酶抑制劑Y-27632(10-5mol/L)刺激30min后,再加入UII(1

6、0-8 mol/L)共孵育3小時,分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)基,用半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞IL-6 mRNA表達量;收集培養(yǎng)液,采用ELISA方法檢測IL6蛋白分泌量。
　　結(jié)果: UII能明顯促進IL-6 mRNA和蛋白的表達。(1)不同濃度UII刺激細(xì)胞后,隨UII濃度增加,細(xì)胞IL-6表達量逐漸增加,至10-8 mol/l UII達到高峰。10-10、10-9、10-8和10-7mol/L UII刺激組IL-6 mRNA表達分別

7、較對照組增加83.70％(P<0.01)、89.60%(P<0.01)、166.60%(P<0.01)和64.10%(P<0.05),而 IL-6蛋白表達量則較對照組分別提高了9.86%(P<0.05)、20.28%(P<0.01)、24.84%(P<0.01)和21.31%(P<0.01)。(2)濃度為10-8 mol/L UII分別刺激細(xì)胞1h、3h、6h、12h和24h后,IL-6 mRNA表達分別較對照組提高72.70%(P<0

8、.01)、98.00%(P<0.01)、59.60%(P<0.01)、35.90%(P<0.05)和30.50%(P<0.05);10-8 mol/L UII刺激成纖維細(xì)胞12h和24h后,IL-6蛋白分泌量較對照組分別增加32.49%(P<0.05)和58.49%(P<0.01)。(3)UII刺激IL-6表達增高的作用能被 UII受體阻斷劑 SB710411、鈣通道阻斷劑 nicardipine(Nic)、MAPK抑制劑PD98059

9、(PD)、PKC抑制劑H7、Rho激酶抑制劑Y-27632(Y2)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑CSA所抑制,IL-6 mRNA抑制率分別為23.38%(P<0.01)、17.23%(P<0.05)、57.56%(P<0.01)、32.94%(P<0.01)、40.08%(P<0.01)和28.84%(P<0.01)。其相應(yīng) IL-6蛋白抑制率分別為18.95%、16.50%、15.62%、17.32%、21.32%和18.96%(均P<0.0