豬白細(xì)胞介素2與白細(xì)胞介素6的克隆、表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)活性研究.pdf

1、豬的一些烈性傳染病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也對(duì)人類健康存在著巨大隱患。目前疫苗免疫仍是我國(guó)豬病防控的主要措施，而佐劑的優(yōu)良直接關(guān)系到疫苗的使用效果，如何在安全劑量疫苗接種下提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力成為當(dāng)今世界疫苗開發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 細(xì)胞因子在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中具有重要作用，又是機(jī)體的自身物質(zhì)，相比傳統(tǒng)佐劑作為免疫增強(qiáng)劑具有更多優(yōu)勢(shì)。白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素6(IL-6)是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生物

2、學(xué)活性。IL-2屬于Th1細(xì)胞因子，主要發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，IL-6屬于Th2細(xì)胞因子，主要發(fā)揮體液免疫功能，兩者在免疫應(yīng)答系統(tǒng)中相輔相成，在分別刺激細(xì)胞與體液免疫的同時(shí)也能相互誘導(dǎo)對(duì)方而開啟另一支路，IL-2與IL-6的這種協(xié)同作用有可能成為一種能夠平衡Th1和Th2應(yīng)答的新型、高效的免疫增強(qiáng)劑。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)開展了pIL-2和pIL-6兩個(gè)基因的克隆、單表達(dá)、融合表達(dá)及融合蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性研究，在表達(dá)策略及純化方法上進(jìn)行了改進(jìn)，過程

3、簡(jiǎn)單易行，有利于產(chǎn)業(yè)化。
　　 以刀豆蛋白(ConA)刺激從豬外周血中分離的淋巴細(xì)胞，提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增pIL-2、pIL-6基因，將擴(kuò)增到的基因分別與pMD18T載體連接后進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，結(jié)果表明:克隆的pIL-2 cDNA全長(zhǎng)為478個(gè)堿基，ORF為465個(gè)堿基，編碼154個(gè)氨基酸，克隆的pIL-6 cDNA全長(zhǎng)為653個(gè)堿基，ORF為639個(gè)堿基，編碼212個(gè)氨基酸，與NCB

4、I/GenBank公布的pIL-2和pIL-6基因比對(duì)同源性均在99％以上，從而證實(shí)成功克隆了pIL-2和pIL-6基因，并用DNAstar等軟件對(duì)序列進(jìn)行了分析。
　　 根據(jù)克隆的pIL-2和pIL-6基因閱讀框序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pET30a進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定，表明pIL-2和pIL-6分別成功插入到pET30a中。用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和wester

5、n-blot分析表明pIL-2和pIL-6蛋白得到了成功表達(dá)，所表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體形式存在，分子量分別約為23KDa和30KDa，經(jīng)凝膠薄層掃描，IL-2和IL-6的最高表達(dá)量分別可達(dá)菌體蛋白的27.4％和59.7％。將包涵體提純、透析復(fù)性后免疫家兔，制備的兔抗豬IL-2和IL-6的多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)效價(jià)均在1∶12800以上。
　　 根據(jù)克隆的pIL-2和pIL-6基因閱讀框序列設(shè)計(jì)將pIL-2和pIL-6成熟

6、肽基因進(jìn)行融合表達(dá)的引物，在pIL-6的下游引物和pIL-2的上游引物中分別設(shè)計(jì)一段柔性的Linker序列，然后利用酶切、連接方法將兩段序列進(jìn)行串聯(lián)后插入到原核表達(dá)載體pBV220中的適當(dāng)位置，獲得重組質(zhì)粒pBVpIL-6-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，42℃誘導(dǎo)表達(dá)得到重組融合蛋白pIL-6-2，分子量約為36.7 kDa，最高表達(dá)量可占菌體總蛋白的40％。wsetern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示pIL-6-2與制備的兔抗pIL-2抗體和pIL-6