山羊白細(xì)胞介素-1β與白細(xì)胞介素-6的克隆表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是一種在動(dòng)物機(jī)體的炎癥發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由單核/巨噬細(xì)胞合成和分泌，通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的分化和增值提高機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-1β還可以提高疫苗的免疫效果，作為潛在的免疫佐劑。將IL-1β作為疫苗佐劑已經(jīng)在綿羊、豬、牛和魚(yú)等動(dòng)物中廣泛研究或使用。
　　 白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種多功效的細(xì)胞因子，其在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血功能以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。機(jī)體許多細(xì)胞

2、都可以合成和分泌IL-6，并且作用于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的某些細(xì)胞。IL-6和IL-1、TNF-α共同作用是機(jī)體急性期反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)有力的誘發(fā)因子。
　　 本研究根據(jù)山羊IL-1β（GenBank登錄號(hào)D63351）和山羊IL-6（GenBank登錄號(hào)D86569），設(shè)計(jì)并合成特異性引物，分別以本實(shí)驗(yàn)室保存的山羊IL-1βcDNA和IL-6 cDNA為模板，擴(kuò)增了山羊IL-1β和IL-6的全

3、序列和成熟肽序列基因。結(jié)果顯示，山羊IL-1β開(kāi)放閱讀框(ORF)為801bp，與CenBank中登錄的山羊IL-1β基因序列（登錄號(hào)D63351）相似性為99.4％，編碼267個(gè)氨基酸。山羊IL-6開(kāi)放閱讀框(ORF)為627bp，切除信號(hào)肽后核苷酸片段大小為552bp，與GenBank中登錄的山羊IL-6基因序列（登錄號(hào)D86569）相似性為99.6％，編碼184個(gè)氨基酸。
　　 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將克隆成功的山羊GIL-

4、1β基因和mGIL-6成熟蛋白基因分別與原核表達(dá)載體pET-28a(+)和pET-32a(+)連接，構(gòu)建了pET-28a(+)-GIL-1β和pET-32a(+)-mGIL-6原核表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解后經(jīng)SDS-PAGE分析，GIL-1β融合蛋白大小為33.07KDa，mGIL-6融合蛋白大小為42.24KDa。GIL-1β融合蛋白主要以包涵體形式存在，mGIL-6融合蛋

5、白則以上清和包涵體兩種形式存在。用His鎳柱將其成功純化后，并對(duì)溶解在尿素中的GIL-Iβ包涵體采用透析復(fù)性法將其復(fù)性。
　　 為了檢測(cè)GIL-1β融合蛋白和mGIL-6融合蛋白的生物學(xué)活性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GIL-1β融合蛋白協(xié)同伴刀豆蛋白A(ConA)促C57BL品系小鼠胸腺細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了GIL-Iβ融合蛋白的活性，結(jié)果顯示重組山羊IL-1β具有明顯促C57BL品系小鼠胸腺細(xì)胞增值效應(yīng)。通過(guò)mGIL-6融合蛋白對(duì)伴刀豆蛋白A(