榮昌豬白細(xì)胞介素-2受體γ鏈基因的克隆、表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、根據(jù)已發(fā)表的豬白細(xì)胞介素-2受體γ鏈基因(porcineinterlukin-2receptorγchain)序列(Genbank登陸號(hào)：NM214083)設(shè)計(jì)合成特異性引物，以ConA誘導(dǎo)的榮昌豬外周血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，用一步RT-PCR方法擴(kuò)增出約1100bp的目的片段。將目的片斷克隆到pMD18-Tsimpie載體上，酶切鑒定及序列測定結(jié)果表明為IL-2Rγ基因。該基因包括豬IL-2Rγ基因全部開放閱讀框1107個(gè)堿基，編碼

2、368個(gè)氨基酸。將所獲得的榮昌豬IL-2Rγ基因與其他已在NCBI刊載的豬IL-2Rγ基因序列進(jìn)行核苷酸序列比較，同源性都在99％以上。所擴(kuò)增的榮昌豬白細(xì)胞介素-2受體γ鏈基因序列在Genbank登陸號(hào)是Eu026383。 參考榮昌豬Ⅱ-2Rγ基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-R一Ⅱ-2Rγ為模板，將榮昌豬Ⅱ-2Rγ不含有信號(hào)肽編碼序列的IL-2Rγ基因(Ⅱ-2Rγm)，亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)

3、，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-R-IL-2Rγm。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定和Western-Blotting分析，原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-R-IL-2Rγm表達(dá)的目的融合蛋白大小為59Kd，占細(xì)菌總蛋白的41.8％。 另將完整的ORF區(qū)(IL-2Rγ)基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-R-IL-2

4、Rγ。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)雙酶切、質(zhì)粒PCR鑒定后，大量提取質(zhì)粒并純化后分三次對小鼠進(jìn)行免疫，流式細(xì)胞儀檢測免疫小鼠T細(xì)胞亞群數(shù)量的變化，說明IL-2Rγ具有一定的促免疫細(xì)胞增殖反應(yīng)活性。 本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)在國內(nèi)首次克隆出榮昌豬的IL-2受體γ鏈基因，構(gòu)建了榮昌豬IL-2Rγ成熟蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了榮昌豬IL-2Rγ重組成熟蛋白的高效表達(dá)。構(gòu)建真核表達(dá)載體并大量提取和純化質(zhì)粒，通過免疫小鼠初步測定其生物學(xué)活性