豬白細胞介素22克隆表達和活性研究及單克隆抗體的制備.pdf

1、白細胞介素22(IL-22)，屬于IL-10家族成員，主要由T淋巴細胞和固有淋巴細胞分泌，在體內(nèi)通過與其受體（IL-22R1和IL-10R2）結合形成異源二聚體受體復合物并激活信號通路來發(fā)揮生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，人和鼠的IL-22在體內(nèi)發(fā)揮抗炎和促炎的雙重作用：一方面，它主要作用于黏膜上皮細胞，在黏膜損傷的修護，炎癥反應及抗感染中發(fā)揮重要作用；另一方面，IL-22在組織中的長期過表達可導致宿主慢性炎癥的發(fā)生。小腸作為宿主免疫的重要場所，

2、是IL-22發(fā)揮生物效應的關鍵部位。近年來對 IL-22的研究主要集中在人源和鼠源，魚IL-22也曾有報道，但豬IL-22的研究尚未見報道。鑒于此，本研究旨在通過以下二方面的研究闡釋豬 IL-22能否發(fā)揮保護宿主抵御病原入侵、抵抗感染的作用，為豬IL-22的研究奠定基礎。
　　(1)豬白細胞介素22的原核表達和活性研究
　　從豬外周血單核細胞衍生的DC細胞中克隆出大小為568 bp的豬IL-22基因序列和去信號肽的IL-22

3、成熟序列。首先將該去信號肽基因片段克隆到原核表達載體 PET-30a(Amp+)中，構建重組質(zhì)粒 PET-30a/IL-22，再將陽性重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達了大小為22 KD的重組蛋白His/IL-22，并利用Ni-NTA親和層析法進行純化。生物學活性檢測結果顯示：純化的His/IL-22對豬IPEC-J2中IL-18、IFN-λ和BD-2均有上調(diào)表達的作用，當用終濃度為0.04μg/mL的重組蛋白處理IPE

4、C-J2細胞時，隨著His/IL-22對IPEC-J2細胞處理時間的延長，細胞中這三種細胞因子表達呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在48 h時，三種細胞因子的表達量均達到最大。此外，病毒增殖抑制試驗發(fā)現(xiàn)His/IL-22具有抑制PEDV-CV777和PoRV在IPEC-J2中復制的作用。這一結果首次證明豬IL-22能夠上調(diào)IPEC-J2中細胞因子的表達，并且?guī)椭鶬PEC-J2抵抗病毒感染。
　　(2)豬IL-22單克隆抗體的制備
　　以

5、前期試驗獲得的具有生物活性的His/IL-22蛋白作為抗原,腹腔免疫6-8周齡雌性BALB/C小鼠，取其脾細胞，通過細胞融合的方法通篩選出了4株能分泌抗豬 IL-22抗體的陽性雜交瘤細胞，分別命名為2G10、2C7、6B11、7F3，這四株細胞分泌的抗體亞型均為IgM K型。根據(jù)預實驗中細胞培養(yǎng)上清抗體效價測定的結果選取了效價較高的6B11和7F3細胞株制備腹水，ELISA測定6B11細胞株培養(yǎng)上清及其腹水效價，分別為1∶50和1∶25