榮昌豬白細(xì)胞介素-2受體α基因克隆、原核表達(dá)及生物活性初探.pdf

1、T免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2能與經(jīng)抗原活化的T淋巴細(xì)胞表面的受體(IL-2Rα)相結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞的快速增殖，產(chǎn)生排斥反應(yīng)。 根據(jù)Genbank基因序列號為U_18317的豬白細(xì)胞介素-2受體α設(shè)計一對特異性引物，經(jīng)刀豆蛋白素A(conA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的榮昌豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)并提取總RNA，RT-PCR方法首次擴(kuò)增出榮昌豬IL-2Rα的全長基因，共813bp。利用NCBI網(wǎng)站軟件BLAST

2、進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示其與已公布的3個參考序列(登錄號：NM213835.1AF036005.1AF052037.1)核苷酸同源性很高，均為98％以上。 運用PCR技術(shù)從含榮昌豬IL-2Rα開放閱讀框序列質(zhì)粒中擴(kuò)增其成熟蛋白編碼基因共774bp。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了PET32a(+)/IL-2Rα融合表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定，DNA測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE結(jié)果顯示表

3、達(dá)的融合蛋白約為45KD，Westernblotting結(jié)果表明融合表達(dá)成功。并檢測其可溶性，試驗確定榮昌豬IL-2Rα重組成熟蛋白表達(dá)的最佳條件為IPTG0.2mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的42.6％。對小白鼠進(jìn)行免疫試驗，測定其CD3+、CD8+、CD4+.用所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-mpIL-2Rα免疫的小鼠的數(shù)量高于空質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)對照組、空白對照組和無