豬白細(xì)胞介素2的巴斯德畢赤酵母表達(dá)及活性測定.pdf

1、[目的]白細(xì)胞介素2主要是由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類重要的細(xì)胞因子，具有激活淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK)和自然殺傷細(xì)胞，刺激T輔助細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和促進(jìn)細(xì)胞因子的繁殖以及刺激T細(xì)胞在體外生長等功能，因此它是在免疫調(diào)節(jié)中有重要作用。豬IL-2基因的成功克隆與活性的測定具有十分重要的意義。本研究旨在獲得具有生物學(xué)活性的重組豬白細(xì)胞介素2，為構(gòu)建新型基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。 [方法]以經(jīng)刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的

2、豬外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR等技術(shù)擴(kuò)增和克隆豬白細(xì)胞介素2的全基因，亞克隆豬白細(xì)胞介素2成熟蛋白基因于真核表達(dá)載體pPICZαA上，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母X-33建立重組豬白細(xì)胞介素2的酵母表達(dá)系統(tǒng)，并以MTT比色法測定表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。 [結(jié)果]以豬外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA為模板，以RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得大小約500bp目的條帶，連接pMDl8-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌D

3、H5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)挑斑、瓊脂糖凝膠電泳、EcoRⅠ和SαlⅠ雙酶切及測序鑒定，獲得含豬白細(xì)胞介素2基因重組質(zhì)粒pMD18-T-PoIL-2的陽性克隆菌。再以該重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出豬白細(xì)胞介素2成熟蛋白的基因片段，連接真核表達(dá)載體pPICZαA并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)挑斑、XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，成功地構(gòu)建了重組豬白細(xì)胞介素2成熟蛋白基因的真核表達(dá)載體pPICZαA-PoIL-2。電轉(zhuǎn)化pPICZαA-PoIL

4、-2于巴斯德畢赤酵母X-33，經(jīng)篩選、PCR鑒定，獲得含豬白細(xì)胞介素2成熟蛋白基因的重組酵母菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定，可產(chǎn)生相對分子質(zhì)量約為18ku的表達(dá)產(chǎn)物，表明成功地建立了重組豬白細(xì)胞介素2的酵母表達(dá)系統(tǒng)。以MTT比色法測定，該重組豬白細(xì)胞介素2具有對豬外周血淋巴細(xì)胞的生物學(xué)活性。 [結(jié)論]本研究成功地建立了重組豬白細(xì)胞介素2成熟蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)，該重組豬IL-2具有對豬外周血淋巴細(xì)胞的生物學(xué)活性