重組人白細(xì)胞介素1β(rhIL-1β)在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及生物學(xué)作用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是一個(gè)重要的促炎性細(xì)胞因子，參與多種疾病的生理病理反應(yīng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于人IL-1β表達(dá)的研究主要是采用原核表達(dá)系統(tǒng)，由于大腸桿菌表達(dá)重組蛋白表達(dá)量低、存在內(nèi)毒素、分離純化復(fù)雜、蛋白回收率低等缺點(diǎn)，因此，本文選用真核表達(dá)系統(tǒng)即巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人IL-1β蛋白，達(dá)到提高蛋白產(chǎn)量和回收率的目的。本文首先根據(jù)編碼人IL-1β的mRNA序列，利用在線優(yōu)化工具對(duì)其基

2、因序列進(jìn)行優(yōu)化，然后分別導(dǎo)入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9、pPIC9K和pPICZαA，成功構(gòu)建人IL-1β重組載體，并將其轉(zhuǎn)染至畢赤酵母菌GS115、SMD1168和X-33，從重組畢赤酵母菌中篩選得到正確且高效表達(dá)的工程菌株，然后進(jìn)一步探討其3L規(guī)模的發(fā)酵條件、產(chǎn)物純化工藝及鑒定其生物學(xué)作用。
　　本文首先對(duì)重組表達(dá)載體pPIC9-hIL-1β、pPIC9K-hIL-1β和pPICZαA-hIL-1β進(jìn)行鑒定，并將其電轉(zhuǎn)化整合到

3、畢赤酵母受體菌GS115、SMD1168和X-33的基因組中，涂布在MD和YPD+Z平板，待長(zhǎng)出單克隆后，用基因組PCR鑒定來篩選陽性克隆，然后通過BMGY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot蛋白鑒定，最終篩選出可正確高效表達(dá)的重組菌株X-33-pPICZαA-hIL-1β。
　　本文在3L發(fā)酵罐規(guī)模下，通過研究誘導(dǎo)階段中不同的起始誘導(dǎo)菌體密度(OD)、溫度、pH、溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)和甲醇濃度及誘

4、導(dǎo)時(shí)間五個(gè)因素對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)影響，從而確定出最佳誘導(dǎo)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，X-33-pPICZαA-hIL-1β工程菌株在3L發(fā)酵規(guī)模下，最佳誘導(dǎo)條件為起始誘導(dǎo)菌體密度(OD600)為600，溫度26℃，pH為5.0，溶氧體積分?jǐn)?shù)20％，甲醇濃度0.25％，誘導(dǎo)3天，rhIL-1β的表達(dá)量最高，可達(dá)280mg/L。
　　本文對(duì)rhIL-1β分離純化方法進(jìn)行了初步研究，研究結(jié)果顯示，首先采用低溫離心法去除大部分菌體，然后

5、用磷酸氫二鉀/無水乙醇雙水相體系對(duì)收集的發(fā)酵液上清進(jìn)行抽提，收集上相溶液，經(jīng)10kD超濾、濃縮，最后經(jīng)DEAE弱陰離子交換層析分離純化方法，可以得到純度在95％左右，收率75％的rhIL-1β。
　　本文分別采用MTT法和Hoechst33258染色法對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行初步的生物學(xué)活性檢測(cè)，MTT法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，rhIL-1β對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2和小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16具有增殖抑制作用，通過顯微鏡觀察rhIL-1β處理過的H