重組人胰島素在畢赤氏酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、糖尿病是一種全身性慢性疾病，病因復(fù)雜，并發(fā)癥多，治愈率低，成為國際醫(yī)學(xué)的一大難題，被世界衛(wèi)生組織稱為不死的癌癥。胰島素是治療糖尿病最基礎(chǔ)、最有效的藥物。目前，國際胰島素市場幾乎全部為基因重組人胰島素所占據(jù)，由于糖尿病屬難以治愈的慢性疾病，患者需終生用藥，其發(fā)病率還隨生活方式的改變和社會老齡化而增加，從而構(gòu)成了人胰島素市場的基礎(chǔ)。胰島素的需求量也呈直線上升的態(tài)勢。所以，胰島素藥物有很大的市場空間。 本研究利用套疊PCR合成Ins

2、ulin基因，并通過克隆、測序驗證了Insulin序列，其大小為183bp，并在Insulin序列的A鏈和B鏈間引入Kex2蛋白酶切位點。經(jīng)測序鑒定后，通過XhoI和XbaI以正確的閱讀框插入到pGAPZα-A的α-factor信號肽下游，構(gòu)建成pGAPZa-A/Insulin重組分泌型表達(dá)載體。表達(dá)載體用BlnI線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)Zeocin抗性篩選、菌落PCR鑒定、SDS-PAGE復(fù)篩獲得6株

3、分泌型Insulin表達(dá)工程菌株，再經(jīng)高Zeocin抗性梯度篩選、SDS-PAGE鑒定，獲得1株高效表達(dá)菌株Ig6。以Ig6為發(fā)酵菌株進(jìn)行發(fā)酵，分別取24h、48h、72h、96h、120h的發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE，確立了最佳表達(dá)時間為96h；重組蛋白的表達(dá)水平為32mg/L，占分泌總蛋白的40％左右。Native-PAGE檢測結(jié)果表明，A鏈和B鏈在分泌過程中通過一系列細(xì)胞器，得以加工、修飾、折疊，形成與天然結(jié)構(gòu)更為相似，具有高度

4、生物活性的重組Insulin。WesternBlot結(jié)果表明，重組蛋白能夠與鼠抗人Insulin抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有與天然Insulin同樣的免疫原性。對重組蛋白進(jìn)行了初步純化及活性分析，利用MTT法檢測工程菌株發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性，結(jié)果表明經(jīng)表達(dá)的重組蛋白具有促進(jìn)Osteoblast細(xì)胞增殖的作用。本研究結(jié)果不僅為重組Insulin的研發(fā)及臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，同時也為小分子肽的基因工程藥物研發(fā)建立了良好的平臺，具有重要理論與實踐意義