重組甲狀旁腺激素在畢赤酵母中的分泌表達及條件優(yōu)化.pdf

1、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone）是保持體內血鈣及磷酸鹽平衡的主要調節(jié)因子，由甲狀旁腺的主細胞產生，其主要的靶器官是骨骼、小腸和腎臟。臨床上用于治療骨骼類疾病，如：低甲狀腺血癥、骨質疏松癥等。采用基因工程的方法生產PTH是低成本獲得髙質量產品的一種途徑，已有研究探索了通過在大腸桿菌中表達hPTH蛋白的技術，但在真核細胞中獲取hPTH的研究則尚少見報道。畢赤酵母（Pichia pastoris）是表達外源蛋白理想的真核

2、表達系統(tǒng)之一，具有嚴格調控外源蛋白的表達、加工修飾表達產物、表達量高、營養(yǎng)要求低等優(yōu)點。
　　本研究旨在構建hPTH的酵母表達體系以獲得更接近人體生理活性的真核表達產品，同時開展表達條件優(yōu)化以摸索發(fā)酵生產的條件。實驗中采用PCR方法擴增出hPTH基因，用限制性內切酶SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切hPTH基因和載體pPIC9K，回收純化后以T4連接酶連接，構建表達載體pPIC9K-hPTH。經限制性內切酶SacI線性化后，用電轉化的方法

3、將表達質粒pPIC9K-hPTH導入畢赤酵母GS115。轉化株通過G418篩選、MM－MD平板篩選和菌落PCR鑒定，獲得了含有目的基因的陽性重組菌株，命名為GS115/pPIC9K-hPTH。將重組菌株在含1％甲醇的BMMY中進行誘導表達，通過SDS-PAGE法對表達產物進行分析，結果表明，hPTH基因在畢赤酵母中成功獲得表達，表達蛋白的分子量約9.5KD。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步優(yōu)化了甲醇誘導時間、甲醇誘導濃度、蛋白酶抑制劑EDTA等對