豬IFN-γ在畢赤酵母中的分泌表達(dá)與功能驗(yàn)證.pdf

1、豬伽馬干擾素（porcine InterferonGamma，pIFN-γ）屬于Ⅱ型干擾素中的唯一成員，主要是由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。研究和構(gòu)建能高效表達(dá)具有高活性、易純化的pIFN-γ基因工程菌，開(kāi)發(fā)pIFN-γ相關(guān)藥物，對(duì)于改善當(dāng)前我國(guó)生豬養(yǎng)殖中存在的抗生素濫用、補(bǔ)充有效抗病毒抗腫瘤藥物和提高豬肉品質(zhì)具有重大意義。
　　本研究以NCBI上公布的pIFN-γ的mRNA序列NM

2、_213948為表達(dá)基因，以甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母X33為表達(dá)宿主，并對(duì)pIFN-γ基因序列進(jìn)行優(yōu)化，先后兩次構(gòu)建了pIFN-γ畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA-pIFN-γ、pPICZαA-pIFN-γ-his tag和pIFN-γC末端突變體畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA-pIFN-γˊ、pPICZαA-pIFN-γˊ-his tag，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot來(lái)分析pIFN-γ的表達(dá)情況。結(jié)果，第一次表達(dá)中得

3、到的pIFN-γ-his tag蛋白無(wú)法經(jīng)Western-blot檢測(cè)與Ni親和層析柱純化；而第二次表達(dá)中得到的pIFN-γ肽鏈C末端突變體pIFN-γ′-his tag，成功通過(guò)了Western-bolt檢測(cè)和Ni親和層析柱純化；將先后兩次構(gòu)建表達(dá)得到的4種蛋白，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)四種蛋白的分子量大小關(guān)系為：pIFN-γˊ-his tag﹥pIFN-γˊ﹥pIFN-γ-his tag≈pIFN-γ。由此推測(cè)，第一次構(gòu)建的p

4、IFN-γ分泌表達(dá)載體未能分泌表達(dá)得到具有完整C端的pIFN-γ，而第二次構(gòu)建的pIFN-γ突變體分泌表達(dá)載體成功分泌表達(dá)得到具有完整C端的pIFN-γ′。
　　將本研究表達(dá)得到的pIFN-γ、pIFN-γ-his tag及其肽鏈C末端突變體pIFN-γˊ、pIFN-γˊ-his tag純化后，分別與仔豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2共培養(yǎng)，通過(guò)RT-qPCR分析受IFN-γ調(diào)控的下游基因Mx1和OAS1、以及不受IFN-γ調(diào)控的基因

5、PKR的表達(dá)情況，比較四種蛋白對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的刺激活性差異。結(jié)果表明，四種蛋白均能極顯著的提高M(jìn)x1和OAS1的表達(dá)水平，均不能顯著提高PKR的表達(dá)水平；突變后的蛋白比沒(méi)突變的蛋白對(duì)Mx1和OAS1的表達(dá)水平上調(diào)幅度更大，差異極顯著。由此說(shuō)明，經(jīng)過(guò)突變表達(dá)載體表達(dá)的pIFN-γ′比突變前具有更強(qiáng)的細(xì)胞刺激活性。經(jīng)測(cè)定，本研究篩選得到的pIFN-γ′-his tag畢赤酵母高產(chǎn)菌株目的蛋白產(chǎn)量達(dá)到了536.4 mg/L，取得了令人滿