凝血因子Ⅷ在畢赤酵母中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,hFⅧ)在人凝血機(jī)制內(nèi)部途徑的級聯(lián)反應(yīng)中起著必不可少的作用,該因子的先天性缺陷會導(dǎo)致甲型血友病。目前,臨床上治療這種疾病多采用蛋白替代療法,即輸入含hFⅧ的制劑。世界上血友病患者眾多,發(fā)病率在1/10000-3/10000。如此大的需求量單靠從血漿中提取無法滿足市場的需求。因此,利用基因工程方法生產(chǎn)hFⅧ無疑具有巨大的商業(yè)價值。鑒于畢赤酵母自身強(qiáng)力的表達(dá)系統(tǒng),本文利用畢赤

2、酵母GS115為受體菌,篩選出能分泌重組人凝血因子Ⅷ(recombinanthuman coagulation factorⅧ,rhFⅧ)的基因工程菌株,并對該蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究。
　　 本文在構(gòu)建rhFⅧ基因工程菌時采用了適合該菌株的分泌型表達(dá)載體pPIC9,成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-FⅧ。該質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化,電轉(zhuǎn)化整合入畢赤酵母GS115的染色體中。經(jīng)基因組PCR篩選出陽性克隆,MM和MD平板篩選出His

3、+Mut+表型,BMGY/BMMY培養(yǎng)基搖瓶振蕩培養(yǎng),SDS-PAGE鑒定培養(yǎng)物上清等步驟,最終得到能表達(dá)rhFⅧ的陽性菌株。對其表達(dá)模式的研究法發(fā)現(xiàn),隨著誘導(dǎo)時間的延長,該蛋白的表達(dá)量增加,并在144h達(dá)到高峰。
　　 本論文通過BMGY/BMMY培養(yǎng)基搖瓶振蕩培養(yǎng)對發(fā)酵條件進(jìn)行了摸索。結(jié)果顯示,在28℃,250rpm,每24h添加1％甲醇的誘導(dǎo)條件下rhFⅧ有微弱表達(dá)。
　　 以上結(jié)果表明,本研究利用畢赤酵母成功表達(dá)

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