重組人組織因子途徑抑制因子在畢赤酵母中的表達、純化及其抗血清的制備.pdf

1、體內(nèi)凝血過程主要有兩種:內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑,內(nèi)源性凝血途徑是由凝血因子Ⅻ啟動,外源性凝血途徑起始于組織因子(Tissue Factor)暴露于血液。外源性凝血途徑又稱組織因子途徑由組織因子作為啟動因子。組織因子途徑抑制因子(TFPI)是具有庫尼茲結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶抑制劑,是外源性凝血途徑的主要抑制因子之一,在動脈粥樣硬化、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血管再狹窄、血栓形成、腫瘤、炎癥及感染性休克等疾病中具有潛在的治療及應(yīng)用前景

2、。因此制備重組人組織因子途徑抑制因子具有一定的臨床價值。
　　 在眾多表達系統(tǒng)中,利用釀酒酵母表達體系表達TFPI產(chǎn)量較低,發(fā)酵培養(yǎng)時產(chǎn)量約0.02 mg/L;昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達TFPI重組蛋白,其表達量只有0.21 mg/L；哺乳動物細胞表達體系所獲得的重組蛋白,產(chǎn)量達2～6 mg/L,但成本昂貴,操作繁瑣,周期長。本研究采用巴斯德畢赤酵母表達重組人組織因子途徑抑制因子,于72小時表達量最高達到7.6231mg/L,重組TF

3、PI對FXa的抑制率也在72小時最高為0.8918。不僅大大提高了重組蛋白的表達量,而且節(jié)約了生產(chǎn)成本。應(yīng)用超濾透析,陰離子交換、凝膠過濾層析法分離純化重組蛋白,純度達90％,收率達55％,重組TFPI對FXa的抑制率為0.5341。本研究探索出低成本,高純度,適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的純化技術(shù)。將純化的重組蛋白與免疫佐劑結(jié)合免疫日本大耳白兔并成功制備效價為1:32的多克隆抗體,為重組人組織因子途徑抑制因子的功能研究及在相關(guān)疾病防治中的應(yīng)用