重組人凝血因子Ⅶ的表達(dá)與純化研究.pdf

1、人凝血因子Ⅶ(human coagulation factor Ⅶ，hFⅦ)是一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，由肝臟合成，在凝血過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，是凝血塊形成起始的關(guān)鍵分子之一。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅶ不僅適用于先天性和獲得性FⅦ缺乏癥的病人，而且還適用于治療存在FⅦ和FⅨ抑制物的血友病病人，以及血小板減少癥和血小板功能障礙病人的出血、止血和出血預(yù)防等；由于FⅦ能夠結(jié)合暴露的組織因子(tissuefactor,TF)而啟

2、動(dòng)外源性凝血途徑，使其在戰(zhàn)傷止血、嚴(yán)重創(chuàng)傷、無(wú)法控制的大面積外科手術(shù)的止血等方面具有獨(dú)特的作用。 血漿中FⅦ的含量非常低，大約為20ff～400ng/ml，屬血漿微量蛋白，難以規(guī)?；苽洌蛑亟M技術(shù)的發(fā)展為許多天然微量蛋白的規(guī)?；苽涮峁┝丝赡?。本研究就人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與純化情況進(jìn)行了探索。 本研究主要包括以下幾部分： 1.人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺

3、乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá) 為了實(shí)現(xiàn)重組人凝血因子Ⅶ(recombinanthumancoagulation factorⅦ，rhFⅦ)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，我們針對(duì)人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ，hFⅦ)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從人胎肝總RNA中釣取人凝血因子ⅦcDNA，將其克隆入pGEM-T載體中，通過(guò)酶切、PCR鑒定及序列測(cè)定，結(jié)果表明我們獲得了全長(zhǎng)為1335bp的hFⅦcDN

4、A基因。 將測(cè)序正確的hFⅦcDNA基因亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA5/FRT/TO中，經(jīng)過(guò)PCR和BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的載體命名為pTO-FⅦ。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pTO-FⅦ和輔助質(zhì)粒pOG44共轉(zhuǎn)染Flp-In 293TR細(xì)胞系，通過(guò)75μg/mL的Hygromycin B壓力篩選，獲得抗性細(xì)胞；挑取抗性細(xì)胞的集落，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞的克隆，獲得了10株克隆

5、細(xì)胞株；分別提取細(xì)胞的基因組DNA，應(yīng)用PCR檢測(cè)目的基因的整合情況；對(duì)于PCR檢測(cè)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，用含有四環(huán)素的表達(dá)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集不同細(xì)胞克隆的表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物中有凝血因子Ⅶ的存在；用凝血因子Ⅶ促凝活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的促凝活性。說(shuō)明成功實(shí)現(xiàn)了重組人凝血因子Ⅶ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。 2．抗人凝血因子Ⅶ單克隆抗體的制備及鑒

6、定 應(yīng)用雜交瘤融合技術(shù)，以重組人凝血因子Ⅶ為抗原免疫Bal b/c小鼠。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)間接ELISA法篩選、融合細(xì)胞有限稀釋法克隆等方法篩選出3株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別是3E8、3D2、1C5，誘生的腹水效價(jià)分別為1：1×10<'7>、1：1×10<'6>、1：1×10<'6>。 用ELISA的方法分別對(duì)克隆化雜交瘤細(xì)胞株的亞類進(jìn)行了鑒定，3株單克隆細(xì)胞株(3E8、3D2、1C5

7、)的亞類分別是IgG2a、IgG1、IgG1：對(duì)單抗的特異性鑒定結(jié)果顯示所制備的單抗與多種血漿蛋白均無(wú)交叉反應(yīng)，表明單抗是特異的。 然后用388雜交瘤細(xì)胞株誘生小鼠腹水，應(yīng)用蛋白A親和層析的方法進(jìn)行單抗的純化，經(jīng)過(guò)蛋白A親和層析，我們獲得了純化的單抗。 人凝血因子Ⅶ單克隆抗體的成功制備與純化，為建立人凝血因子Ⅶ檢測(cè)及純化方法奠定了基礎(chǔ)。 3．應(yīng)用單克隆抗體親和層析法純化重組凝血因子Ⅶ 將制備并純化的388

8、單抗與CNBr-Sepharose 6B Fast Flow進(jìn)行偶聯(lián)，制備單克隆抗體偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)McAb-Sepharose 6B FF，為了對(duì)制備的McAb-Sepharose 6B FF進(jìn)行親和層析驗(yàn)證，我們用重組凝血因子Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了層析試驗(yàn)和條件的優(yōu)化，結(jié)果表明我們所制備的層析柱能夠特異性地結(jié)合重組凝血因子Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)品；對(duì)層析條件進(jìn)行優(yōu)化，表明用20mmol/L的PBS作為結(jié)合緩沖液，含1mol/L NaCl的PBS作為洗脫緩

9、沖液具有較好的層析效果。 在層析柱驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，我們開(kāi)展了細(xì)胞表達(dá)重組凝血因子Ⅶ的純化試驗(yàn)，首先將細(xì)胞表達(dá)上清用DEAE-Sephadex A-50進(jìn)行吸附，吸附產(chǎn)物用Sephadex G-25脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理并更換為結(jié)合緩沖液；然后將脫鹽處理的表達(dá)產(chǎn)物用McAB-Sepharose 6B Fast Flow進(jìn)行親和層析，結(jié)果顯示在用洗脫緩沖液洗脫時(shí)獲得了單一的洗脫蛋白峰。 進(jìn)而對(duì)洗脫蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE、Wes