凝血因子Ⅷ的純化.pdf

1、凝血因子Ⅷ是目前一種重要的臨床用藥，廣泛應(yīng)用于甲型血友病、血管性血友病、纖維蛋白原缺乏癥、獲得性凝血因子Ⅷ缺乏癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、獲得性凝血因子Ⅷ抑制物所致疾病等疾病，受到醫(yī)藥工業(yè)的高度重視。用于臨床的凝血因子Ⅷ主要是從血液中分離出來的。過去幾十年間，治療血友病甲的凝血因子Ⅷ濃縮物不斷取得進(jìn)展。凝血因子Ⅷ分離制備方法主要有甘氨酸沉淀法、PEG分段沉淀法、PEG-甘氨酸沉淀法、肝素-酸性沉淀法等。90年代，隨著凝膠層析技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用日益

2、成熟，層析介質(zhì)的開發(fā)，越來越多的凝膠過濾提純法、離子交換層析法、疏水層析法、單抗親和層析等方法應(yīng)用于凝血因子Ⅷ的產(chǎn)業(yè)化制備。我國(guó)現(xiàn)在用于治療的凝血因子Ⅷ都是血液來源的，國(guó)外的重組凝血因子Ⅷ在中國(guó)的注冊(cè)還沒有獲批。目前由于原料血漿供應(yīng)不足，凝血因子Ⅷ產(chǎn)量的驟減導(dǎo)致了臨床供應(yīng)的緊張。華蘭生物股份有限公司是我國(guó)能生產(chǎn)凝血因子Ⅷ的四家生物公司之一。目前采用PEG沉淀法制備的血源凝血因子Ⅷ，雖然工藝成熟可靠，但凝血因子Ⅷ比活(3-5IU/mg)和

3、回收率較低。離子交換層析法有利于微量血漿蛋白的工業(yè)化分離，且能通過層析容易地去除病毒滅活S/D試劑而無需其它額外的去除方法，整個(gè)過程簡(jiǎn)單易行；故計(jì)劃引入離子交換層析法來提高凝血因子Ⅷ的比活和回收率。 凝血因子Ⅷ原料為血漿，純化工藝為新鮮冰凍血漿-PEG沉淀-S/D處理-離子交換層析。實(shí)驗(yàn)中采用DEAE-650M陰離子膠作為層析介質(zhì)來純化凝血因子Ⅷ。影響離子交換層析的因素有離子強(qiáng)度、pH、溫度和流速，本文主要探討離子強(qiáng)度和pH對(duì)離

4、子交換制備FⅧ的影響。先采用線性梯度洗脫法，初步篩選制備凝血因子Ⅷ平衡緩沖液含氯化鈉的濃度范圍和洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度；然后在同一pH條件下，改變平衡緩沖液中氯化鈉的含量，計(jì)算在每種平衡緩沖液下凝血因子Ⅷ的回收率和比活，選擇最佳的平衡緩沖液的氯化鈉的含量；再在同一離子強(qiáng)度條件下，改變pH值，通過計(jì)算凝血因子Ⅷ回收率和比活，選擇最佳pH值。最后通過正交法去驗(yàn)證不同離子強(qiáng)度和pH值組合，從而篩選出最佳組合。本實(shí)驗(yàn)可以看出離子強(qiáng)度和pH值均