重組人KGF-1蛋白的表達(dá)、純化及活性研究.pdf

1、角質(zhì)化生長因子(KGF-1)是成纖維母細(xì)胞生長因子家族(FGFs)的一員，又名成纖維細(xì)胞生長因子7(FGF-7)。其特異性受體FGFR2Ⅲb僅表達(dá)于各種上皮細(xì)胞，所以KGF-1僅特異作用于上皮細(xì)胞。這一特性使得KGF-1蛋白藥物在給藥時(shí)定向性更好，同時(shí)也更加安全。2004年，美國AMGEN公司研發(fā)的帕利夫明注射液（即Kepivance）通過FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥為治療惡性血液病患者的嚴(yán)重口腔黏膜炎。KGF-1的潛在應(yīng)用價(jià)值還還有治療由于

2、代謝疾病引起的慢性傷口愈合、早產(chǎn)兒表面活性劑的不足與支氣管肺發(fā)育不良、急性肺損傷、急性肝損傷的治療等。雖然KGF-1蛋白在醫(yī)學(xué)上有著很大的應(yīng)用潛力，但是目前對于重組KGF-1蛋白表達(dá)的研究仍在處于探索階段。KGF-1蛋白已經(jīng)在大腸桿菌、CHO細(xì)胞及植物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行過表達(dá)，結(jié)果都并不令人十分滿意。SUMO是一種類泛素蛋白，結(jié)構(gòu)與泛素蛋白十分相似。與泛素化不同的是，生物體內(nèi)蛋白的sumo化(sumoylation)反應(yīng)可以加強(qiáng)靶蛋白

3、的穩(wěn)定性、幫助靶蛋白正確轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊、影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性。近年來，SUMO蛋白融合標(biāo)簽被越來越多的運(yùn)用于表達(dá)一些過去難以表達(dá)的蛋白質(zhì)，顯著提高了這些蛋白的表達(dá)量及可溶性。
　　本研究應(yīng)用重疊PCR技術(shù)，將poly His-sumo標(biāo)簽基因序列與N端缺失23個(gè)氨基酸殘基的rhKGF-1基因序列拼接，構(gòu)建融合基因6His-sumo-rhKGF1。將融合基因與非融合基因分別克隆至表達(dá)載體pET30a和pJW2上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。將重組

4、表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白，篩選表達(dá)量最高的重組表達(dá)質(zhì)粒。對得到的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)嘗試通過改變誘導(dǎo)條件來提高蛋白表達(dá)量。工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)之后，進(jìn)行超聲破碎處理，離心后，取上清經(jīng)鎳柱純化。收集純化得到的融合蛋白，SUMO Protease處理切除SUMO標(biāo)簽，再經(jīng)鎳柱純化獲得rhKGF-1蛋白。利用人永生化表皮細(xì)胞（HaCat細(xì)胞）模型，經(jīng)CCK-8顯色，檢測rhKGF-1的生物活性。通過對

5、上述內(nèi)容的研究，得到以下結(jié)果:1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-rhKGF-1、pET30a-6His-sumo-rhKGF-1、pJW2-rhKGF-1、pJW2-6His-sumo-rhKGF-1經(jīng)雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證證明成功構(gòu)建。通過誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出陽性表達(dá)載體pET30a-6His-sumo-rhKGF-1。2.對融合基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，摸索了誘導(dǎo)表達(dá)的三個(gè)因素的條件，均未能提高融合蛋白的表達(dá)量。3.經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重