重組人β分泌酶(BACE1)的表達(dá)純化及酶學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、BACE1抑制劑的活性評(píng)價(jià)和作用模式研究需要大量活性良好的BACE1。商品BACE1成本很高，因此需要利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)大量制備BACE1。為此本研究分別構(gòu)建了攜帶proBACE1和BACE1編碼序列的分泌型畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46，以及攜帶proBACE1編碼序列的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-MetBACE22，用于表達(dá)proBACE1和BACE1重組蛋白。結(jié)果

2、顯示大腸桿菌表達(dá)的重組proBACE1無(wú)活性，而轉(zhuǎn)入proBACE1基因的重組畢赤酵母9k-B22的發(fā)酵液上清活性明顯高于轉(zhuǎn)入成熟型BACE1基因的重組菌株9k-B46的發(fā)酵液上清活性。SDS-PAGE/高碘酸-希夫試劑染色發(fā)現(xiàn)純化得到的proBACE1是被高度糖基化的蛋白（在SDS-PAGE上表現(xiàn)為85 kD為中心的分散條帶），其糖基化可以被糖苷內(nèi)切酶Endo Hf完全切除，得到50kD左右的兩條蛋白帶。使用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定發(fā)現(xiàn)，分

3、子量較高的條帶與proBACE1匹配，而另外一條與BACE1匹配。這說(shuō)明proBACE1可以在畢赤酵母中加工為成熟型。本研究還發(fā)現(xiàn)純化的proBACE1存在一定程度的自催化現(xiàn)象，導(dǎo)致42 kD和39kD兩條蛋白帶的出現(xiàn)?；钚詸z測(cè)發(fā)現(xiàn)糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）表達(dá)的商品BACE1，去除糖基化后活性降低了40％，這說(shuō)明糖基化及其類型對(duì)BACE1活性非常重要。本課題組以前分離得到的BACE1