重組GluV8的克隆表達、純化及酶學性質(zhì)研究.pdf

1、背景:谷氨酰內(nèi)切酶能特異性地切割與谷氨酸殘基C-端結(jié)合的肽鍵,在生物制藥及質(zhì)譜檢測中應(yīng)用較多但來源受限,近年來隨著質(zhì)譜技術(shù)及抗體類藥物的發(fā)展谷氨酰內(nèi)切酶得到了進一步的重視。現(xiàn)在應(yīng)用較多的谷氨酰內(nèi)切酶是從金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清中提取獲得的,金黃色葡萄球菌V8菌種來源的內(nèi)切酶GluV8由336個氨基酸組成,包括含有68個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽序列以及C-端尾部由52個氨基酸殘基組成的12個重復(fù)折疊的三肽結(jié)構(gòu)。GluV8在金黃色葡萄球菌或枯草桿菌

2、中進行表達的技術(shù)已較為成熟,但在大腸桿菌中表達時存在自身激活現(xiàn)象及目的蛋白以包涵體形式存在這兩個問題,因此商業(yè)化的GluV8還未有在大腸桿菌中表達的報道。
　　目的:在大腸桿菌表達系統(tǒng)中獲得以上清形式表達的有活性的重組GluV8,探究前導(dǎo)肽序列及 C-端尾部重復(fù)序列在GluV8發(fā)揮酶切活性中的作用,用較簡單的純化過程獲得目的蛋白。
　　方法:去除GluV8的前導(dǎo)肽序列及C-端尾部的重復(fù)序列,將GluV8功能區(qū)部分對應(yīng)的基因進

3、行適當改造后,分別克隆入表達載體pGEX-4T-2、pET32a+進行融合表達,導(dǎo)入E.coil BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達, SDS-PAGE檢測蛋白表達結(jié)果,親和層析等純化技術(shù)對成功表達的目的蛋白進行純化,用特異性的化學發(fā)光底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA(L-2135)對重組 GluV8的酶切特性進行鑒定,HPLC檢測方法對重組酶酶切胰島素的位點特異性進行鑒定,LC-MS/MS檢測方法對重組酶酶切CTLA4-Fc融合蛋白所

4、得質(zhì)量肽圖譜、重組酶酶切抗體的位點特異性進行檢測。
　　結(jié)果:(1)在大腸桿菌中用pGEX-4T-2表達載體獲得了以可溶性形式表達的重組蛋白,目的蛋白約24KD,目的蛋白純度為97.77％;(2)以Z-Phe-Leu-Glu-pNA(L-2135)作為底物時重組GluV8的相對活性為1568U/mg,反應(yīng)的Km值、Vmax分別為0.870mmol/L和78.43 mmol/mg?min,在42℃、pH8.0時活性最強,50℃、pH

5、10.0時仍有較高的活性;(3)HPLC檢測結(jié)果表明重組酶酶切胰島素有5個特異性峰的出現(xiàn)、酶切位點正確;(4)LC-MS/MS檢測結(jié)果表明重組酶酶切CTLA4-Fc融合蛋白所得質(zhì)量肽圖譜覆蓋率為100％;(5)LC-MS/MS檢測結(jié)果表明重組酶酶切抗體的位點正確、具有酶切特異性。
　　結(jié)論:(1)在大腸桿菌中獲得了以可溶性形式表達的重組蛋白;(2)對GluV8功能區(qū)部分進行了表達,證實 GluV8的前導(dǎo)肽序列及 C-端尾部的重復(fù)序