柞蠶溶繭酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)表征及其基因克隆與表達(dá).pdf

1、血栓性疾病日益威脅著人們的生命健康，現(xiàn)有的抗栓或溶栓藥物種類繁多，根據(jù)作用機(jī)制不同，發(fā)揮著重要的作用。然而這些藥物普遍存在半衰期短、纖維蛋白親和力差或出血風(fēng)險(xiǎn)大等缺陷，因此開(kāi)發(fā)新型溶栓藥物仍然十分必要。柞蠶(Antheraea pernyi)屬鱗翅目大蠶蛾科，是典型的吐絲營(yíng)繭昆蟲(chóng)之一。在蠶蛹羽化過(guò)程中，下顎腺會(huì)分泌吐出液，水解繭殼中的絲膠，蠶蛾便可“脫繭而出”了。在其吐出液中含有一種酶，稱其為溶繭酶(cocoonase)，不僅可以水解絲

2、膠，還具有精氨酸酯酶活力，與胰蛋白酶性質(zhì)相近，有望開(kāi)發(fā)成為一種新型溶栓藥物。
　　根據(jù)前人的初步研究，利用CM-Sepharose FastFlow弱陽(yáng)離子交換層析和SephadexG-50兩步法從柞蠶吐出液中分離得到柞蠶溶繭酶。通過(guò)精氨酸酯酶活力測(cè)定了其酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和最適溫度及pH值，利用纖維蛋白原降解實(shí)驗(yàn)和纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了其溶栓功能。根據(jù)N端測(cè)序的氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RACE技術(shù)克隆得到柞蠶溶繭酶基因全長(zhǎng)，

3、并利用大腸桿菌和Bac to Bac昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功純化出柞蠶溶繭酶，其酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值和Vmax分別為2.577×10-3 mol/L和4.09×10-3μmol/L/s，且其最適溫度和最適pH值分別為30℃和pH8.0?？寺∪芾O酶基因全長(zhǎng)783 bp，編碼261個(gè)氨基酸，通過(guò)BLAST同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，柞蠶溶繭酶含有胰蛋白酶家族保守序列“IVGG”。利用MEGA5.0軟

4、件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)柞蠶溶繭酶與家蠶溶繭酶具有62％的相似度，屬于同一進(jìn)化分支。通過(guò)PROSITE蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸34-260為絲氨酸蛋白酶家族保守域，并且發(fā)現(xiàn)多個(gè)絲氨酸蛋白酶家族特有的模型。
　　通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品濃度達(dá)200 mg/ml時(shí)，Hela細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化，活細(xì)胞數(shù)有所減少。皮內(nèi)注射柞蠶溶繭酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其出血活性(MHD)為2.5 mg/kg體重。體外溶血試驗(yàn)中，當(dāng)加入30μg溶繭酶時(shí)，24