蛹蟲草纖溶酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及溶栓抗栓作用研究.pdf

1、血栓性疾病包括急性心肌梗死，缺血性心臟病，心血管疾病，心臟瓣膜病，周邊血管疾病，心律失常，高血壓等，日漸威脅著人類的健康。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，心血管疾病已經(jīng)占全世界死亡率的29％。鑒于此，溶栓抗栓藥物的研制開發(fā)已成為國內(nèi)外研究熱點之一。目前用于血栓性疾病治療的藥物都不同程度具有纖維蛋白特異性差、體內(nèi)半袁期短、生產(chǎn)成本高、需大劑量連續(xù)周藥等缺點。于是，國內(nèi)外專家學(xué)者，逐漸將目光投向?qū)ふ乙恍┌踩院?、副作用小、?/p>

2、效好的天然來源的溶栓藥物。 蟲草菌是我國傳統(tǒng)名貴中藥，屬子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草菌屬(Cordyceps(Frey)Link)，是一種蟲生真菌；在民間，常常被稱為冬蟲夏草。藥理學(xué)研究表明在增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤，抗細(xì)菌和抗真菌等方面具有良好功效；蛹蟲草因與

3、冬蟲夏草有著相似的結(jié)構(gòu)和功能，近年來備受各界關(guān)注。迄今為止，蛹蟲草是否具有纖溶功能還未見報道。 本研究首次篩選到一株產(chǎn)生高活性纖溶酶的SN-18菌株，進(jìn)行了形態(tài)和分子鑒定；優(yōu)化了培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，進(jìn)而對蛹蟲草纖溶酶進(jìn)行分離純化，研究了酶學(xué)性質(zhì)以及體內(nèi)和體外的溶栓抗栓功能，為進(jìn)一步研究與應(yīng)用開發(fā)提供了必要的工作基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 一、纖溶活性菌株SN-18的分離鑒定及產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵特性研究 1.根

4、據(jù)菌絲形態(tài)，分生孢子形態(tài)以及人工培養(yǎng)產(chǎn)生的子座形態(tài)對分離篩選到的具有最強(qiáng)的纖溶活性編號為SN-18菌株進(jìn)行鑒定，初步推測為蛹蟲草. 2.對基因組DNA的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域的PCR產(chǎn)物測序，將測序結(jié)果運用Blastn程序與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對分析，篩選與SN-18同源性較高的典型菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。根據(jù)序列相似性分析結(jié)果得知：菌株SN-18與蛹蟲草C.miitarisAY899258和蛹蟲草擬青霉P

5、aecilomgcesmilitarisDQ342250、DQ342248具有相當(dāng)高的同源性，相似性達(dá)100％，結(jié)合形態(tài)鑒定的結(jié)果可以判斷SN-18就是蛹蟲草。 3.采用單因素試驗法確定了SN-18產(chǎn)纖溶酶的最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基組成為面粉1％，蠶蛹粉5％，接種量10％；培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速160r/m，裝液量30mL/250mL，溫度25℃，培養(yǎng)時間為6天。發(fā)酵液纖溶酶活力達(dá)到32.34U/ml，是未優(yōu)化前的PDA液體培養(yǎng)

6、基的2.31倍。 二、蛹蟲草纖溶酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì) 1.蛹蟲草液體發(fā)酵液離心，獲得粗酶液，粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，收集活性成份，經(jīng)凝膠層析達(dá)到電泳純。 2.酶活最適pH和最適溫度為pH6.0和25℃。Mg2+和Fe2+促進(jìn)酶活，EDTA和Cu2+抑制酶活。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得出單一條帶，其近似分子量為27.3kDa。N端氨基酸序列為IVGGVSVAIE(Swissprot登錄號P85318)

7、 三、蛹蟲草纖溶酶溶栓、抗栓作用研究 1.溶栓作用實驗表明： 蛹蟲草纖溶酶具有直接降解纖維蛋白的纖溶活性。 體外對毛細(xì)管血凝塊溶解實驗結(jié)果為：毛細(xì)管血凝塊于37℃培養(yǎng)3h后，蛹蟲草纖溶酶(12U/ml)組的溶解率為29.49％，與生理鹽水空白對照組(3.01％)差異顯著(P<0.01).注入蛹蟲草纖溶酶的毛細(xì)管由于其中的血凝塊被溶解而使管內(nèi)的溶液變紅，血凝塊明顯變短變細(xì)，而且在管內(nèi)隨液體滑動，阻塞消除.而空白

8、對照則保持阻塞狀態(tài). 體外對血凝塊溶解實驗結(jié)果為：蛹蟲草纖溶酶分別取24U/ml、24U/ml、12U/ml、6U/ml四個濃度，以尿激酶12U/ml為陽性對照和生理鹽水為空白對照，各取8ml，在37℃，90r/min條件下，12小時之內(nèi)，考察對0.5g的血凝塊的溶解率。結(jié)果為24U/ml、12U/ml、6U/ml三個濃度對血凝塊的溶解率分別為99％、53.4％、14.2％、8.6％和4.4％，且三個濃度組呈量效關(guān)系。24U/m

9、l濃度組在12h后，試管中完全看不到血凝塊，其溶解后的微粒懸浮在試管中，使試管內(nèi)液體由澄清變混濁。而尿激酶12U/ml陽性對照組，還可以看到成型的血凝塊，溶液的顏色和做為空白的生理鹽水組相近，還較澄清。 2.抗栓作用實驗表明： 蛹蟲草纖溶酶粗制液在體內(nèi)8min之內(nèi)就對大鼠血小板性動脈血栓形成具有明顯的抑制作用，蛹蟲草纖溶酶中劑量組(ivCMase12U/kg)在體內(nèi)對大鼠血小板性動脈血栓形成的抑制作用與尿激酶(iv250

10、U/kg)相當(dāng)，二者差異不顯著；中(ivCMase12U/kg)，高劑量(ivCMase18U/kg)給藥組與空白對照組有顯著差異(P<0.01)，并且三個給藥組呈量效關(guān)系。 蛹蟲草纖溶酶粗制液在體內(nèi)8min之內(nèi)就對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集具有明顯的抑制作用，蛹蟲草纖溶酶中劑量組(ivCMase12U/kg)對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制作用與尿激酶(iv500U/kg)相當(dāng)，二者差異不顯著，中(ivCMase12U/kg