根霉纖溶酶液態(tài)發(fā)酵、分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、血栓性疾病嚴(yán)重威脅人類生命和健康，近年發(fā)病率有增加趨勢。溶栓療法是血栓性疾病安全且有效的手段。目前臨床使用的溶栓藥物主要是纖溶酶原激活劑類，盡管這些藥物的療效肯定，但還存在許多缺陷，而且價(jià)格昂貴。因此研制高效、快速、價(jià)廉的新型溶栓藥物的需求迫切。 本論文對根霉RhizopuschinensisYY-15液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了該菌株發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的制備分離純化方法，研究了該菌株產(chǎn)生纖溶酶的部分酶學(xué)性質(zhì)。

2、 優(yōu)化了根霉RhizopuschinensisYY-15菌株產(chǎn)纖溶酶液體搖瓶發(fā)酵條件。首先對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)法研究了不同碳源、不同氮源、不同碳氮比例、不同培養(yǎng)基初始pH對菌株發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的影響，確立了培養(yǎng)基各組成成份的適宜水平。進(jìn)一步采用正交實(shí)驗(yàn)對菌株發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的發(fā)酵時(shí)間和接種量進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，麩皮和豆粕是該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的適合碳源和氮源。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最適培養(yǎng)基組成是：麩皮濃度3％(w/v

3、)，豆粕濃度5％(w/v)，培養(yǎng)基初始pH5.0。適宜接種量6％，培養(yǎng)時(shí)間72h。根霉RhizopuschinensisYY-15在優(yōu)化條件下液體搖瓶發(fā)酵平均產(chǎn)酶量為98.31U/ml(尿激酶單位)。 對根霉RhizopuschinensisYY-15產(chǎn)生纖溶酶的制備分離純化工藝進(jìn)行了探索和研究，建立了酶的分離提純工藝。根霉液體發(fā)酵液中的纖溶酶用40％～70％飽和度硫酸銨分步鹽析、PhenylSepharoseFastFlow疏

4、水相互作用色譜、DEAE-SepharoseFF離子交換色譜和SephacrylS-100凝膠過濾色譜順序分離后，可得到經(jīng)高分離度的疏水相互作用色譜ResourcePhe證明為均一的纖溶活性組分。用上述流程將纖溶酶提純了90.5倍，活力回收46.5。 對用上述流程提純的纖溶酶的部分性質(zhì)進(jìn)行了研究。凝膠層析方法測定根霉纖溶酶分子量為20.3kDa。等電聚焦方法測定該酶等電點(diǎn)8.2。纖溶酶比活力2416.86U/mg。纖溶酶最適作用

5、溫度50℃，37℃保溫4h酶活力保持88％，43℃和50℃保溫4h酶活力保持57％和32％，60℃保溫1h酶活力保持53％。纖溶酶最適作用pH為8.8，最穩(wěn)定的pH范圍是6.8～8.8，在該pH范圍內(nèi)，37℃保溫24h，酶活力保存80％以上。酶的pH穩(wěn)定性很好。酶與氨基酸側(cè)鏈修飾試劑在37℃保溫30min后，EDTA、PMSF和Aprotinine對纖溶酶有抑制作用，而且隨著抑制劑濃度的增大，其抑制作用也增加；而抑制劑PCMB、Lys和