一種纖溶酶SPFE-Ⅲ的生物制備、分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、血栓栓塞性疾病主要包括腦血栓、心肌梗死、靜脈血栓等，是目前臨床上死亡率最高的疾病之一，并且在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率正逐年上升，因此人們一直都在研制開(kāi)發(fā)新型的溶血栓藥物。本文從亞洲傳統(tǒng)發(fā)酵食品--是醬中篩選到一株產(chǎn)纖溶酶能力較強(qiáng)的菌株，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心定名為Bacillus sp.nov.SK006(CCTCC NO.:M205071)，已經(jīng)證明該菌株能產(chǎn)生四種不同的纖溶酶，本文在優(yōu)化該菌產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上，主要對(duì)芽孢桿菌Bacillu

2、s sp.nov.SK006產(chǎn)生的其中一種纖溶酶(SPFE-Ⅲ)作了深入的研究。
　　 首先在搖瓶水平上考察了培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件對(duì)Bacillus sp.nov.SK006發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶能力的影響，結(jié)果表明該菌株產(chǎn)酶最佳的培養(yǎng)基組分為:葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨30 g/L，Na2HPO4·12H2O15 g/L，NaH2PO4·2H2O1.3 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，CaCl20.1 g/L；最佳培養(yǎng)條件

3、:種齡18 h，接種量3%，發(fā)酵周期24 h，初始pH為7.0，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度37℃，在此條件下發(fā)酵液纖溶活性(以plasmin為標(biāo)準(zhǔn))高達(dá)2.63 U/mL，是優(yōu)化前0.70 U/mL的3.76倍。
　　 芽孢桿菌Bacillus sp.nov.SK006的發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀、離子交換層析(DEAE-Sepharose CL-6B)、凝膠過(guò)濾層析(Superdex75)后分離純化出一種電泳純的纖溶酶SPFE

4、-Ⅲ，分子量約為42.8 kDa，酶活為7.1 U/mg(以plasmin為標(biāo)準(zhǔn))。SPFE-Ⅲ對(duì)纖維蛋白原的降解過(guò)程為最先降解Q鏈，其次是γ鏈，而對(duì)β鏈的降解最緩慢；利用加熱纖維蛋白平板法研究纖溶酶SPFE-Ⅲ對(duì)纖維蛋白的作用方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)纖維蛋白有直接降解作用，而對(duì)纖溶酶原的敏感性較低。
　　 其次研究了純化后纖溶酶SPFE-Ⅲ的酶學(xué)性質(zhì):最適反應(yīng)溫度為30-40℃，最適反應(yīng)pH范圍為7.0-8.0，在40℃下保溫1

5、h剩余酶活力約為60%，而在50℃保溫1 h剩余酶活力只有30%左右，纖溶酶SPFE-Ⅲ對(duì)高溫較為敏感。金屬離子實(shí)驗(yàn)表明:在實(shí)驗(yàn)選擇的范圍內(nèi)，除Ba2+外其它金屬離子對(duì)纖溶酶SPFE-Ⅲ纖溶活性均有一定程度的抑制作用，其中Cu2+、Mn2+、Fe3+和Zn2+的抑制作用較強(qiáng)，抑制率為50%左右。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明:蛋白酶抑制劑對(duì)纖溶酶SPFE-Ⅲ有不同程度的抑制作用，EDTA和β-毓基乙醇對(duì)纖溶酶SPFE-Ⅲ都有較強(qiáng)的抑制作用。
　　

6、 最后分別選擇了三種人工合成的發(fā)光底物D-Val-Leu-Arg-pNA、D-Val-Leu-Lys-pNA和N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA與纖溶酶SPFE-Ⅲ反應(yīng)。SPFE-Ⅲ對(duì)底物N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有最強(qiáng)的專一性，其酰胺水解活性是75.77 AU，該底物是胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的最適底物。對(duì)N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的米氏常數(shù)Km為0.239