一種新型海洋纖溶酶的研究.pdf

1、血栓性疾病是西方富裕國(guó)家人類(lèi)死亡的首要原因。它主要危害心、腦、肺的血管系統(tǒng),造成成年人死亡或殘疾。在美國(guó),每年大約有60萬(wàn)人發(fā)生肺栓塞,其中約20萬(wàn)人死亡:每年約有100萬(wàn)人發(fā)生急性心肌梗塞,其中20多萬(wàn)人需要住院進(jìn)行治療。在我國(guó),每年大約有200萬(wàn)人死于栓塞性心腦血管疾病,每年需要進(jìn)行溶栓治療的病人超過(guò)300萬(wàn)。并且,這類(lèi)疾病的發(fā)病率也有逐年上升趨勢(shì)。 血栓性疾病的主要治療手段是溶栓,迄今溶栓劑已發(fā)展了三代,但都有一定的副作

2、用。有鑒于此,我們從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物單環(huán)刺蜢中尋找和分離了一種新型纖溶酶?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果分述如下:1.單環(huán)刺蜢纖溶酶在單環(huán)刺蜢的血液及內(nèi)臟組織中含量豐富,其大量制備工藝為:體腔液及內(nèi)臟混合物經(jīng)勻漿、PBS抽提、(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級(jí)鹽析、超濾、Q.Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75、Sepllacry S-100層析分離,最終獲得純酶。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的本工藝可以高效率地提取這種新型海洋纖溶酶,

3、并達(dá)到了電泳純,在SDS-PAGE電泳圖譜上顯示一條帶。 2.經(jīng)SDS-PAGE和Native-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,單環(huán)刺蜢纖溶酶分子量約為10,380 Da。與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的陸地生物來(lái)源的纖溶酶以及海洋生物來(lái)源的纖溶酶相比,分子量相對(duì)較小。而苯酚一硫酸法測(cè)定糖含量表明,單環(huán)刺 纖溶酶含糖量極低,所以可能不是糖蛋白。 3.與蚓激酶類(lèi)似,單環(huán)刺蜢纖溶酶既可直接水解纖維蛋白,又具有激酶活性,通過(guò)激活纖溶酶原并使之

4、轉(zhuǎn)化為纖溶酶,從而間接地水解纖維蛋白。因而該酶具有很高的纖維蛋白親合性和酶活力。以尿激酶為對(duì)照,測(cè)得酶的比活力為5256U/rag。 4.單環(huán)刺蜢纖溶酶體外抗凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的酶均具有顯著的抗凝作用,并且酶濃度越高,抗凝效果也越好。在酶濃度相同的情況下,單環(huán)刺蜢纖溶酶的抗凝效果要優(yōu)于蚓激酶。而且,單環(huán)刺 纖溶酶作用相對(duì)溫和,對(duì)細(xì)胞損傷小。與此相比，蚓激酶對(duì)個(gè)別紅細(xì)胞的細(xì)胞膜具有一定程度的損傷作用。 5.單環(huán)刺

5、蜢纖溶酶體外溶解兔血栓實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的酶均具有顯著的溶栓作用，并且酶濃度越高，溶栓效果也越好。在酶濃度相同的情況下，單環(huán)刺蜢纖溶酶的溶栓作用效果要優(yōu)于蚓激酶。而且，單環(huán)刺蜢纖溶酶對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較小。與此相比，蚓激酶對(duì)個(gè)別紅細(xì)胞的細(xì)胞膜具有一定程度的損傷作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在wiStar大鼠血栓溶解實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。 6.在37℃條件下，單環(huán)刺<蟲(chóng) 益>纖溶酶、蚓激酶與新鮮兔血栓作用2h后的血栓溶解率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：蚓激酶50.

6、66％；單環(huán)刺蟲(chóng)益纖溶酶89.76％。單環(huán)刺蜢纖溶酶的血栓溶解率顯著超過(guò)蚓激酶。 7.以酪蛋白為底物，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.1％時(shí)，酶反應(yīng)速度隨底物濃度增加而增加；當(dāng)?shù)孜餄舛燃s為0.1％時(shí)，酶反應(yīng)速度最大；而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)0.1％時(shí)，酶反應(yīng)速度隨底物濃度增加反而下降，顯示出底物濃度對(duì)單環(huán)刺<蟲(chóng)益>纖溶酶具有顯著的抑制作用，其機(jī)理與反競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)似。 8．以酪蛋白為底物，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-BLirk

7、plot)求出的酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)為：Km=0.05：Vmax=3.08 mol／min。 9.理化性質(zhì)研究表明，單環(huán)刺縊纖溶酶具有較高的穩(wěn)定性。當(dāng)溫度在50℃以下時(shí)，3 h內(nèi)酶的活性基本保持不變。該酶在10種不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的緩沖液中于4℃放置24 h后，酶的活性相當(dāng)穩(wěn)定。尤其是在偏堿性的pH范圍內(nèi)，酶的活性更好。當(dāng)pH為11時(shí)，4℃放置24 h后的殘余酶活力為96％，然而當(dāng)pH繼續(xù)增

8、加，殘余酶活力開(kāi)始下降。 10．單環(huán)刺蜢纖溶酶的最適反應(yīng)溫度約為50℃。酶在pH 7.5～pH 8.5的偏堿性環(huán)境中活力最好，可能是動(dòng)物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。 11．在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e<'3+>和Ag<'+>離子是單環(huán)刺蜢纖溶酶的抑制劑，而Fe<'2+>、Mn<'2+>和Cu<'2+>離子是該酶的激活劑，其他參與實(shí)驗(yàn)的金屬離子，包括Mg<'2+>、Ca<'2+>、zn<'2+>、Li<'+>、 Fe<

9、'25+>、 Ba<'2+>、 K<'+>、Na<'+>，在0.01 mol/L時(shí)對(duì)該酶活性的影響不顯著。 12．Fe<'2+>和Fe<'3+>離子有可能在單環(huán)刺<蟲(chóng)益>體內(nèi)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)纖溶酶活性。當(dāng)Fe<'2+>離子濃度從0.001 tol/L提高到0.01 mol/L時(shí)，殘余酶活力略有增加，而當(dāng)濃度繼續(xù)增加到0.1 m01/L時(shí)，殘余酶活力急劇提高到原先的5.5倍。與此相反，當(dāng)Fe<'3+>離子濃度為0.1 mol／L和0