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文檔簡介
1、膽鹽水解酶降低人體血清膽固醇的功能可應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌具有降低膽固醇的能力,這與其所產(chǎn)膽鹽水解酶有關(guān),因此本實(shí)驗(yàn)選用植物乳桿菌為出發(fā)菌株,發(fā)酵產(chǎn)膽鹽水解酶,對其培養(yǎng)基成分及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化、并對膽鹽水解酶進(jìn)行分離純化,研究了該酶的部分酶學(xué)性質(zhì),為其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。
為了提高菌株的產(chǎn)酶能力,本研究對植物乳桿菌產(chǎn)膽鹽水解酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。利用單因素實(shí)驗(yàn)研究不同碳源、氮源
2、、無機(jī)鹽對酶產(chǎn)量的影響,并確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的主要組成。在此基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖19.40、蛋白胨17.05、大豆蛋白胨14.00、乙酸鈉1.82、K2HPO42.00、酵母浸粉6.00、檸檬酸氫二銨1.00、MgSO40.87、MnSO40.45、L-半胱氨酸0.5、吐溫-802.2mL/L。利用該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶,使膽鹽水解酶的產(chǎn)量由原來的1.09U/mL提高到7.02±0.28U/mL,提高了
3、6.44倍。用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得了最佳產(chǎn)酶條件為:初始pH值6.2;培養(yǎng)溫度39℃;接種量7%;裝液量50%。根據(jù)植物乳桿菌的生長曲線和產(chǎn)酶曲線確定最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間為20h。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,膽鹽水解酶活可以達(dá)8.41±0.13U/mL,比原始提高了7.72倍。
對所產(chǎn)的膽鹽水解酶進(jìn)行分離純化。將粗酶液進(jìn)行硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-SepharoseFastFlow、SephadexG-100凝膠過濾層析,
4、將所得到的膽鹽水解酶進(jìn)行SDS-PAGE檢測,得到膽鹽水解酶的分子量約為40kDa。經(jīng)過純化后的蛋白酶比活力由6.62AU提高到168.02AU,純化倍數(shù)為24.78倍,回收率達(dá)到13.28%。
將純化得到的膽鹽水解酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。該酶的最適溫度為37℃,在20-35℃范圍內(nèi)放置80min,該酶仍能保持80%以上活性;最適pH值為6.0,在pH4-10的范圍內(nèi)該酶活性比較穩(wěn)定,37℃處理1h后,殘留酶活力在80%以上
5、;金屬離子對酶活性有一定影響,當(dāng)添加的金屬離子濃度為1mmol/L時(shí),Pb2+、Hg2+、Fe3+、Al3+對膽鹽水解酶活力有一定抑制作用,Cu2+、Ca2+對膽鹽水解酶活力有微弱促進(jìn)作用;當(dāng)有機(jī)溶劑濃度為1%時(shí),正丙醇對該酶有微弱激活作用;當(dāng)有機(jī)溶劑的濃度由1%升到10%時(shí),甲醇、乙醇對該酶有抑制作用,其酶活力分別為對照組的34.84%、49.27%;膽鹽水解酶的最適底物為5mmol/L的?;悄懰徕c溶液;SDS、H2O2、Pepsta
6、inA、Leupeptin在一定程度上對膽鹽水解酶有較強(qiáng)抑制作用。當(dāng)SDS濃度分別為1mmol/L和5mmol/L時(shí),殘余酶活力分別為69.90%和68.80%;當(dāng)H2O2濃度為1%和10%時(shí)殘余酶活力分別為40.67%和23.98%;當(dāng)PepstainA濃度分別為0.1μmol/L和1μmol/L時(shí),殘余酶活力分別為47.69%和40.08%;當(dāng)Leupeptin濃度分別為10μmol/L和100μmol/L時(shí),殘余酶活力為53.76
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