豆芽中磷酸吡哆醛水解酶的分離純化與表征.pdf

1、維生素B6(VB6)是一類吡啶類化合物的總稱,有吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)、磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)這六種形式,它們可以相互轉(zhuǎn)換。其中PLP是VB6的主要輔酶形式,催

2、化氨基酸的代謝反應(yīng)。PLP含有一個強活潑性的醛基,極易與胺基結(jié)合形成醛亞胺,這可能會導(dǎo)致生物體內(nèi)物質(zhì)的紊亂。在生物體內(nèi),受磷酸酶的作用,體內(nèi)游離的PLP濃度通常維持在一個較低的水平。
　　PLP的水解是控制細(xì)胞內(nèi)游離PLP水平的一個重要機制。微生物和哺乳動物體內(nèi)PLP水解的研究較為清楚,受到非特異性酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的作用,同時存在特異性PLP磷酸酶。植物體內(nèi)PLP水解機制的研究起步較晚,發(fā)揮作用的酶有待明確。本實驗以豆芽為實

3、驗材料,PLP為底物進行純化,可能得到特異性的PLP磷酸酶。同時以通用型底物pNPP(p-Nitrophenylphosphate)為底物進行純化,得到的為普通的磷酸酶。對兩種底物純化出的酶進行比較,以確定豆芽中水解PLP的磷酸酶是否是特異性的磷酸酶。
　　以PLP為底物純化出的酶最適pH為5.5,Mg2+、Zn2+和Mn2+對該酶有激活作用,其中Mg2+作用最強,氟化物和鉬酸鹽對其活性有抑制作用。在最適反應(yīng)條件下,測得反應(yīng)底物P

4、LP和pNPP的Km值為0.27mmol/L和0.14mmol/L,該酶并未對PLP表現(xiàn)出很強的親和力。
　　以pNPP為底物純化出的酶最適pH為5.5,Mg2+、Zn2+和Mn2+對該酶有激活作用,其中Mg2+作用最強。氟化物和鉬酸鹽對其活性也有抑制作用,該酶對多種磷酸酯型底物都表現(xiàn)出較強的活性,在最適反應(yīng)條件下,測得反應(yīng)底物PLP和pNPP的Km值為0.18mmol/L和0.16mmol/L。
　　通過酶學(xué)性質(zhì)比較,以P